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嗜肺军团菌简易鞭毛染色法及在不同培养基上鞭毛的生长观察

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中国微生态学杂志 1990年第3期2卷 57-59页

作者：刘少有贾力敏万超群中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所北京102206

本文报道了一种较为简易、快速的嗜肺军团菌 Legionella pneumophila 鞭毛染色法,并探讨了嗜肺军团菌在两种培养基(BCYE、NYE)上鞭毛的生长情况。实验结果提示这种鞭毛染色法有助于军团病的病原学诊断。

关键词：嗜肺军团菌鞭毛

空肠弯曲杆菌假定转录调节子Cj0440c对鞭毛合成调控机制的初步研究

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空肠弯曲杆菌假定转录调节子Cj0440c对鞭毛合成调控机制的初步研究

作者：刘明月华中农业大学

学位级别：硕士

空肠弯曲杆菌(Camplylobacter jejuni)是全球范围内引起人和动物食源性腹泻的主要病原菌,有研究发现,C.jejuni的发病机制与鞭毛在宿主上皮细胞的定植力、黏附、侵袭力以及毒素的产生密切相关。本实验室前期研究发现在红霉素诱导的耐药... 详细信息

空肠弯曲杆菌(Camplylobacter jejuni)是全球范围内引起人和动物食源性腹泻的主要病原菌,有研究发现,C.jejuni的发病机制与鞭毛在宿主上皮细胞的定植力、黏附、侵袭力以及毒素的产生密切相关。本实验室前期研究发现在红霉素诱导的耐药空肠弯曲杆菌中cj0440c出现上调表达;在C.jejuni NCTC11168中,cj0440c基因缺失突变后,该菌的鞭毛出现断裂,且鞭毛相关基因出现差异表达。cj0440c基因对鞭毛的具体调控机制尚不清楚,NCBI上注释该基因为假定转录调节子,但尚未有研究发现其能调节哪些基因的表达。有研究表明,Cj0440c的同源蛋白TenA(两者同源性为30.7%)为一个硫胺素酶,能参与到硫胺素的合成代谢,猜测Cj0440c也可能具有硫胺素酶的作用。为了研究cj0440c基因的功能,本研究通过观察在不同药物处理下菌株中cj0440c与鞭毛相关基因的表达量,分析cj0440c与各鞭毛基因之间的关系;在大肠杆菌里重组表达Cj0440c蛋白,通过酶解实验验证Cj0440c蛋白是否参与硫胺素的代谢途径;构建空肠弯曲杆菌过表达载体,尝试利用染色质免疫共沉淀的方法体内筛选Cj0440c直接调控的目的基因;通过凝胶阻滞实验体外验证Cj0440c蛋白与前期基因芯片结果中cj0440c缺失突变后差异表达的九个鞭毛相关基因之间的相互作用。测定弯曲杆菌对九种药物(红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、庆大霉素、依替米星、四环素、替加环素、恩诺沙星、加替沙星)的MIC以及MPC,确定各种药物的选择突变窗(MSW),筛选出1/2MPC药物浓度的耐药菌,分析cj0440c以及鞭毛相关基因的表达量。结果显示,在NCTC11168的耐药菌株中,除了替加环素耐药菌中cj0440c下调表达外,其他药物的耐药菌中cj0440c均上调表达。在红霉素诱导的耐药菌中cj0440c上调表达,cj1338c也上调表达,与前期研究中,红霉素耐药菌株cj0440c缺失突变后,cj1338c下调表达结果相符。在所选的两种氨基糖苷类药物以及两种四环素类药物的耐药菌中,其他四个基因的表达趋势与cj0440c一致。而在所选的两种氟喹诺酮类药物中,cj0440c上调表达,cj1338c和cj1339c均下调表达,cj0043和cj0697均上调表达。在ATCC33559的耐药菌株中,除了在红霉素、阿奇霉素、庆大霉素这三种药物的耐药菌中cj0440c上调表达,在其他药物的耐药菌中均下调表达。在红霉素和庆大霉素的耐药菌中cj0440c以及其他的鞭毛基因均上调表达。当cj0440c出现下调表达时,这四个鞭毛基因中至少会有一个基因出现下调表达。反向证明cj0440c能够引起鞭毛相关基因的差异表达。利用pET28a构建含有cj0440c基因的原核表达重组载体P-440,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,采用抗His标签的抗体通过Western-blot来验证表达的融合蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析得到纯化的Cj0440c。以硫胺素为底物,通过观察Cj0440c能否催化硫胺素的降解产生4-甲基-5-羟乙基噻唑和4-氨基-5-羟基甲基-2-甲基嘧啶来验证该蛋白是否具有硫胺素酶的功能。结果表明,反应后的体系中并未发现硫胺素的分解产物。利用大肠杆菌DH5α-空肠弯曲杆菌穿梭载体pRY112构建含有cj0440c的表达载体,用于在C.jejuni中进行染色质免疫共沉淀从体内筛选Cj0440c的调控基因。过表达载体构建成功后,尝试自然转化、电转化以及接合转移的方式将载体转入到空肠弯曲杆菌中,但均未成功,最终改为体外的方式验证Cj0440c对目的基因的调控作用。根据实验室前期研究,挑选出cj0440c缺失突变菌株中九个差异表达的基因(cj1026c(假定脂蛋白)、cj1729c(鞭毛钩蛋白FlgE)、cj1466(鞭毛钩相关蛋白FlgK)、cj0687c(鞭毛基体L环FlgH)、cj0697(鞭毛基体棒蛋白FlgG2)、cj0698(鞭毛基体棒蛋白FlgG)、cj1632c(假定的周质蛋白)、cj1339c(鞭毛蛋白FlgA)以及cj1462(鞭毛基体P环FlgI))进行凝胶阻滞实验。结果发现Cj0440c蛋白不能直接与上述九个基因的启动子片段相结合。综上所述,在九种药物诱导的耐药菌株中,cj0440c与各鞭毛相关基因都出现差异表达,且表达量与红霉素耐药菌株中的表达量以及cj0440c缺失突变菌株中差异表达量相符。当cj0440c下调表达时,所选的四个鞭毛相关基因中至少会有一个基因下调表达,间接验证了cj0440c能够参与到鞭毛的合成代谢。本研究成功表达Cj0440c蛋白,硫胺素酶解实验验证该基因并不具有硫胺素酶的作用。凝胶阻滞实验中,Cj0440c蛋白并不能直接与cj1026c、cj1729c、cj1466、cj0687c、cj0697、cj0698、cj1632c

关键词：空肠弯曲杆菌 cj0440c 鞭毛硫胺素调控机制

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鳗弧菌鞭毛超微结构的电镜观察

电子显微学报 2015年第5期34卷 443-446页

作者：房海陈翠珍靳晓敏葛慕湘张东林河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室河北昌黎066600

通过透射电镜观察鳗弧菌(Vibrio anguillarum)鞭毛的超微结构。本文以分离自大菱鲆(Scophthalmus maximus)及中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的致病性鳗弧菌菌株,并以鳗弧菌模式株ATCC 19264为参考菌株,采用磷钨酸负染色方法后,电镜观... 详细信息

通过透射电镜观察鳗弧菌(Vibrio anguillarum)鞭毛的超微结构。本文以分离自大菱鲆(Scophthalmus maximus)及中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的致病性鳗弧菌菌株,并以鳗弧菌模式株ATCC 19264为参考菌株,采用磷钨酸负染色方法后,电镜观察其鞭毛超微结构。结果观察到一系列特殊的超微结构,包括防护套状、拳头状、旗帜状、杆状、扳指状、粘液状和卵圆状结构。这些细菌鞭毛的特殊超微结构可能与鳗弧菌的毒力相关。

关键词：鳗弧菌鞭毛特殊超微结构电镜

苏云金芽胞杆菌鞭毛合成调控初步探究和砷氧化菌株Acidovorax sp.NO1的插入序列分析

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苏云金芽胞杆菌鞭毛合成调控初步探究和砷氧化菌株Acidovorax sp....

作者：朱小丽华中农业大学

学位级别：硕士

本研究主要包括苏云金芽胞杆菌鞭毛合成调控研究和砷氧化细菌Acidovorax sp.NO1插入序列分析两部分的工作,下面将分别讲述这些工作进展。鞭毛是细菌的运动器官,是细菌在进化过程中长期适应的结果。它在细菌鉴别与分类、致病性、抗原性... 详细信息

本研究主要包括苏云金芽胞杆菌鞭毛合成调控研究和砷氧化细菌Acidovorax sp.NO1插入序列分析两部分的工作,下面将分别讲述这些工作进展。鞭毛是细菌的运动器官,是细菌在进化过程中长期适应的结果。它在细菌鉴别与分类、致病性、抗原性等方面具有重要意义。目前,国内外对于鞭毛调控机理的研究多见于革兰氏阴性的动植物病原菌,而对于对多数昆虫具有毒杀作用的苏云金芽胞杆菌,鞭毛的表达调控机理尚不清楚。苏云金芽胞杆菌中华亚种CT-43是不产鞭毛的双毒力菌株。本课题组通过基因组测序发现CT-43中有关鞭毛合成相关基因都是存在的,但是在鞭毛基因簇前端缺少了一对鞭毛开关基因motP-motS和与细菌趋化性相关的双组分基因cheY-cheA。为此,本文对CT-43的鞭毛相关基因进行了研究。 1)通过BLAST对YBT-1520, BMB171,以及CT-43基因组中鞭毛相关基因进行核苷酸和氨基酸序列比对发现,鞭毛合成相关基因在这三株菌中都具有很高的同源性;2)构建了pHT1K-PlipcheYATS和pHTlK-PlipmotPSTS表达载体,但是由于CT-43内生质粒太多,表达载体未能转入CT-43;3)通过RT-PCR检测了CT-43中鞭毛部分结构基因和Ⅲ型分泌系统基因的表达情况,均可以检测到转录产物;4)通过Western blotting检测了CT-43胞内外鞭毛丝蛋白的表达情况。虽然可以在CT-43胞外检测到FliC和Hag蛋白的表达,但所检测到的量远远小于苏云金亚种HD-2。CT-43的生化反应与HD-2相同,并且这两株菌的鞭毛丝蛋白具有100%的相似性。正常条件下,鞭毛蛋白FliC和Hag在对数期大量表达,并输送至胞外参与鞭毛丝的组装。鞭毛丝蛋白可能是表达量太低或者是发生大量降解而不能积累,从而不能满足鞭毛丝组装的需求。插入序列(Insertion Sequence, IS)是一种广泛存在于原核基因组的最为简单并且具有高度可移动性的转座因子,倾向于影响与环境适应性相关的功能基因的表达,是基因组进化的重要影响因素。本研究通过对Acidovorax sp. NO1这株分离于金矿表层土壤的具有三价砷(As(III))氧化和硝酸盐还原的细菌的基因组序列的分析,最终确认了64个插入序列,包括30个完整的转座元件的和一些转座酶截短的插入序列,分属于15个家族,是已测序食酸菌株中插入序列类型较为多样的环境菌株。为了了解插入序列在NO1中的分布与功能,本研究全面分析了其含有的每种插入序列的拷贝数,基因组定位以及是否插入功能基因中等。结果发现,IS3和IS5家族的插入序列在菌株NO1中分布最为广泛,并且这两个家族的插入序列在已测序食酸菌株中基本上都是存在的。分析了所有转座酶编码基因临近基因功能,发现Tn3转座酶和临近的解离酶分别和砷酸盐还原基因簇ars以及汞抗性基因簇mer组成一个转座子,而IS256家族的插入序列下游均是钴锌隔抗性相关的CzcCBA外排系统等,这说明NO1为了适应环境通过插入序列获得了一些新的功能。另外初步分析发现NO1的插入序列均插入在非编码区。食酸菌属的菌株主要包括分离于土壤和水体的环境菌株以及可以使作物长斑和褐变的植物病原菌,目前NCBI已经公布了9株食酸菌的全基因组序列和注释信息。本研究对这9株菌的插入序列进行了重新注释和修正,旨在探究插入序列对菌株功能和进化方向的影响。 1)共有18个家族的插入序列分布在本研究的9株菌的基因组中,并且每株食酸菌中插入序列的数目都拥有多拷贝(5个拷贝以上),说明食酸菌进化史上均发生过近期的大规模转座事件。这18个家族的插入序列在环境菌株都存在,而植物致病菌中只存在5个插入序列家族,说明插入序列在环境样品中具有多样性。 2)在环境来源的菌株基因组中,很多与环境适应性相关的基因簇旁边存在着插入序列,而植物致病菌中则没有这一现象。并且植物致病菌所特有的与致病相关的基因如果胶酶,Ⅲ型分泌系统等周边也没有插入序列存在,可能是因为这些基因是古老的,而环境菌株在进化过程中丢失了这些特性。 3)通过比较基因组的的分析,对在食酸菌中分布广泛的插入序列家族进行了系统发育分析。结果表明大部分插入序列的进化关系与食酸菌各菌株的亲缘关系并不一一对应,说明同一家族多个插入序列的分化发生在各菌株分化之前,但是同来自环境菌株的部分插入序列形成了聚类,这说明插入序列的进化和其宿主的生活环境是有关系的。虽然前部分工作由于转化难题未能获得更好的实验材料进行更深入的研究,但是证实了motPS和cheYA缺失不会影响鞭毛基本结构的表达。通过插入序列的分析,初步证实了插入序列对食酸菌的功能分化起到了推进作用。

关键词：苏云金芽胞杆菌鞭毛 motPS cheYA 食酸菌插入序列进化

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鸭沙门氏菌鞭毛抗原的提取与抗原性鉴定初报

中国农学通报 2007年第9期23卷 73-76页

作者：徐耀辉乔宏兴臧金灿李翠平卢建洲郑州牧专动物医药系郑州450011 河南省商丘市动物检疫站商丘476000

【研究目的】提取沙门氏菌鞭毛蛋白并鉴定其抗原性;【方法】选用鸭沙门氏菌经半固体培养基诱导鞭毛,经肉汤培养后,用酸裂解、经差速离心、硫酸铵沉淀,分离出粗制鞭毛蛋白。将粗制的鞭毛蛋白用SDS-PAGE和磷钨酸负染投射电镜观察,并包板做... 详细信息

【研究目的】提取沙门氏菌鞭毛蛋白并鉴定其抗原性;【方法】选用鸭沙门氏菌经半固体培养基诱导鞭毛,经肉汤培养后,用酸裂解、经差速离心、硫酸铵沉淀,分离出粗制鞭毛蛋白。将粗制的鞭毛蛋白用SDS-PAGE和磷钨酸负染投射电镜观察,并包板做ELISA检测其抗原性;【结果】SDS-PAGE显示提取的鞭毛蛋白相对分子质量约为58.0KD,且纯度较高,抗原性较好,每1000ml培养液可获得32.8mg鞭毛蛋白;【结论】酸裂解法可获得高质量的鞭毛蛋白,抗原性较好,为禽副伤寒沙门氏菌病诊断方法的建立奠定了基础。

关键词：鸭沙门氏菌鞭毛提取抗原性鉴定

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卡氏膜球藻鞭毛伸缩节律的研究

武汉植物学研究 1994年第4期12卷 355-359页

作者：李夜光胡鸿钧中国科学院武汉植物研究所

卡氏膜球藻（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓｃａｒｔｅｒａｅ）是一种单细胞海藻，细胞圆球形，表面覆盖一层球形石（Ｃｏｃｃｏｌｉｔｈｓ）。两条鞭毛稍不等长，着生于细胞前端，鞭毛长约为细胞直径的１．５倍。在２５±℃，光照强度２００... 详细信息

卡氏膜球藻（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓｃａｒｔｅｒａｅ）是一种单细胞海藻，细胞圆球形，表面覆盖一层球形石（Ｃｏｃｃｏｌｉｔｈｓ）。两条鞭毛稍不等长，着生于细胞前端，鞭毛长约为细胞直径的１．５倍。在２５±℃，光照强度２０００ｌｘ，光暗时间比１４：１０小时条件下，用ＭＥＳⅢ培养基培养卡氏膜球藻，发现细胞在光照条件下伸出鞭毛，活跃游动；在黑暗条件下缩回鞭毛，沉于培养瓶底。进一步试验证明：１．光刺激细胞伸出鞭毛，黑暗刺激细胞缩回鞭毛。２．鞭毛的伸缩与培养中的光暗周期变化严格对应，即光周期开始后２０分钟，细胞开始伸出鞭毛；暗周期一开始，鞭毛就向细胞内收缩。３．在连续光照条件下，鞭毛的周期性伸缩现象消失。所以，卡氏膜球藻鞭毛周期性伸缩是一种受光暗周期调节的外源节律。这种鞭毛伸缩的节律现象在藻类是第一次报道。

关键词：鞭毛节律卡氏膜球藻

fliY基因失活减弱沙福芽孢杆菌ST7菌株的锰氧化能力

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微生物学通报 2023年第1期50卷 107-117页

作者：朱忠梅吴莉丹张心仪方争林牛熙黄世会王嘉福冉雪琴贵州大学生命科学学院贵州大学农业生物工程研究院山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室贵州贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

【背景】沙福芽孢杆菌ST7菌株具有较强的锰氧化能力,但其分子机制不清楚。【目的】着重研究鞭毛马达开关蛋白基因(fliY)对沙福芽孢杆菌锰氧化能力的影响。【方法】根据同源重组原理,以沙福芽孢杆菌ST7菌株为起始菌株,构建fliY基因敲除... 详细信息

【背景】沙福芽孢杆菌ST7菌株具有较强的锰氧化能力,但其分子机制不清楚。【目的】着重研究鞭毛马达开关蛋白基因(fliY)对沙福芽孢杆菌锰氧化能力的影响。【方法】根据同源重组原理,以沙福芽孢杆菌ST7菌株为起始菌株,构建fliY基因敲除的突变株ΔfliY,测定菌落迁徙、细菌生物膜和锰氧化率等,研究fliY基因突变后菌株的运动能力、生物膜生成和锰氧化能力是否发生变化。【结果】经克隆测序,证实突变株ΔfliY中fliY基因的后半段被卡纳霉素抗性基因取代,fliY基因失活;与野生型菌株ST7相比,突变株ΔfliY在全营养的LB培养基中生长变化不大,但在含锰的PYCM培养基中,突变株的生长速度减慢、菌落较小、生物膜生成量显著下降,运动性和锰氧化能力分别下降65%和20%。【结论】fliY基因不仅影响菌株的生长和运动,而且参与细菌的趋化和锰氧化等生物学过程。

关键词：沙福芽孢杆菌鞭毛马达开关蛋白基因生物膜鞭毛锰氧化

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沙门菌鞭毛基因表达的相变换研究进展

安徽农业科学 2010年第34期38卷 19254-19255,19265页

作者：张海方江苏大学基础医学与医学技术学院医学生物化学系江苏镇江212013

沙门菌是目前研究较多的细菌之一,广泛分布于脊椎动物的肠道和很多种类的节肢动物中。大多数沙门菌为Ⅱ相菌株,具有鞭毛相变换的特征,这与其毒力和逃避宿主免疫监视有关。综述了沙门菌鞭毛相变换的研究进展,为进一步研究沙门菌的致病机... 详细信息

沙门菌是目前研究较多的细菌之一,广泛分布于脊椎动物的肠道和很多种类的节肢动物中。大多数沙门菌为Ⅱ相菌株,具有鞭毛相变换的特征,这与其毒力和逃避宿主免疫监视有关。综述了沙门菌鞭毛相变换的研究进展,为进一步研究沙门菌的致病机制提供了理论依据。

关键词：沙门菌鞭毛相变换

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维氏气单胞菌转录因子AsfR调控tmRNA介导鞭毛功能研究

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维氏气单胞菌转录因子AsfR调控tmRNA介导鞭毛功能研究

作者：常慧敏海南大学

学位级别：硕士

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A.veronii)是一种引发水产动物以及人类多种疾病的革兰氏阴性致病菌,严重威胁人类的公共健康以及生产生活,但其致病机制尚不明确。细菌反式翻译核心组分tm RNA(transfer-messenger RNA)参与维持细菌的... 详细信息

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A.veronii)是一种引发水产动物以及人类多种疾病的革兰氏阴性致病菌,严重威胁人类的公共健康以及生产生活,但其致病机制尚不明确。细菌反式翻译核心组分tm RNA(transfer-messenger RNA)参与维持细菌的蛋白质合成质量,对细菌的应激反应、抗生素耐药性和致病性产生重大影响。哪些调控因子对tm RNA的生物学功能产生影响,目前还不清楚。实验室前期构建的卷积神经网络系统预测到,A.veronii C4中一个Ara C家族的转录调控因子可能参与tm RNA的上游调控,我们将其命名为Asf R(Ara C Superfamily Regulator)。Asf R含有一个保守的HTH Ara C家族的DNA结合功能域以及一个Gyr I类似的小分子结合功能域。细菌单杂交和EMSA实验证实asf R与ssr A(编码tm RNA)的基因启动子的结合作用。e GFP荧光报告系统和q PCR分析证实asf R正向调控tm RNA的转录表达。转录组数据分析结果表明Δssr A中一些鞭毛组装相关基因下调。q PCR实验结果进一步证实了转录组数据,同时结果显示相较于WT,Δasf R和Δssr A菌株中鞭毛合成基因fli E表达量显著降低。Swimming以及Swarming结果显示,Δasf R、Δssr A、Δasf RΔssr A菌株运动能力显著低于WT。鞭毛是生物膜形成的重要因素,结果发现Δasf R、Δssr A、Δasf RΔssr A菌株的生物膜形成能力显著低于WT,而Asf R以及tm RNA的基因回补株的成膜能力则恢复。此外,Δasf RΔssr A菌株在M9培养基中完全丧失了生长能力,氨基酸的补充则恢复了其生长能力。本研究结果表明,Asf R通过正调控tm RNA,促进了鞭毛合成基因fli E的转录,进而介导调控A.veronii C4的鞭毛运动以及生物膜形成的生命活动进程。鞭毛Ⅲ型分泌系统不仅为细菌提供运动能力,而且调控细菌毒力、生物膜形成、致病性等多种生命活动,而生物膜是细菌应对宿主的免疫系统以及抗生素等药物的一种顽固的防御方式。本研究首次鉴定了Asf R的生物学功能,并阐明转录因子Asf R调控tm RNA介导鞭毛功能的机制以及Asf R和tm RNA对细菌生长的影响,拓展了tm RNA的生物学功能,为深入探究A.veronii C4的致病机制以及解决细菌耐药性提供了一定的理论基础。

关键词： AsfR tmRNA 转录调控鞭毛生物膜生长