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类鼻疽杆菌鞭毛蛋白flic与EHEC O157∶H7 EspA蛋白的融合表达及其免疫学性质研究

免疫学杂志 2013年第3期29卷 251-255页

作者：于波方瑶顾江王海光程琰李倩唐彬李娜张小玲邹全明毛旭虎第三军医大学医学检验系临床微生物及免疫学教研室国家免疫生物制品工程技术研究中心重庆400038

目的融合表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FilC与肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 EspA蛋白,并评价其免疫学性质。方法 PCR扩增类鼻疽杆菌FilC编码基因bpsl3319,连接到基于EHEC O157 EspA的表达载体pEspA上,表达并纯化EspA-flic融合蛋白,Western blo... 详细信息

目的融合表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FilC与肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 EspA蛋白,并评价其免疫学性质。方法 PCR扩增类鼻疽杆菌FilC编码基因bpsl3319,连接到基于EHEC O157 EspA的表达载体pEspA上,表达并纯化EspA-flic融合蛋白,Western blot分析其抗原性;EspA-flic免疫Balb/c小鼠评价其免疫原性。结果获得了bpsl3319目的基因,构建了重组表达质粒pEspA-bpsl3319;实现了EspA-FilC的高效表达,其表达量约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度超过85%。Westernblot结果显示EspA-flic能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EHEC O157∶H7 EspA的单抗和多抗血清发生特异性抗原抗体反应。EspA-FilC免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG,且此抗体能识别EspA-FilC、EspA以及天然类鼻疽杆菌的flic。结论重组表达了融合蛋白EspA-FilC,该蛋白具有较好的免疫反应性和良好的免疫原性。此研究为下一步研制类鼻疽杆菌和EHEC O157的二联疫苗奠定了基础。

关键词：类鼻疽杆菌鞭毛蛋白flic 肠出血性大肠杆菌O157 EspA 疫苗

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鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

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食品科学 2013年第9期34卷 180-184页

作者：陈明徐幸莲周光宏汤晓艳袁飞陈爱亮中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所农业部农产品质量安全重点实验室北京100081 南京农业大学食品科技学院肉品加工与质量控制教育部重点实验室江苏南京210095 中国检验检疫科学研究院北京100123

利用PCR扩增出鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因flic,连接到原核表达载体pET28a(+)上,测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建了原核表达系统。经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导及Ni-NTA纯化后,得到了带6×Hi... 详细信息

利用PCR扩增出鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因flic,连接到原核表达载体pET28a(+)上,测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建了原核表达系统。经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导及Ni-NTA纯化后,得到了带6×His纯化标签的分子质量大小约为54.6kD的表达产物,和预测蛋白大小一致,且大部分表达产物以可溶形式存在利用Western-blotting进一步鉴定,结果表明,该蛋白能与抗His标签的单抗发生特异性反应。用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗体,并对抗血清的效价和特异性进行检测,结果表明,多抗的效价较高,特异性较好。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic 原核表达纯化鉴定多克隆抗体

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类鼻疽杆菌鞭毛蛋白flic与肠出血性大肠杆菌蛋白EspA的融合表达及其免疫学性质研究

类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与肠出血性大肠杆菌蛋白EspA的融合表达及...

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作者：于波第三军医大学

学位级别：硕士

类鼻疽(Melioidosis)疾病是由类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）引起的一种热带亚热带地区人畜共患传染病。由于类鼻疽病易感动物的广谱性、疾病的高致死性以及流行范围不断扩大的趋势，该病已经成为全球的公共卫生问题... 详细信息

类鼻疽(Melioidosis)疾病是由类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）引起的一种热带亚热带地区人畜共患传染病。由于类鼻疽病易感动物的广谱性、疾病的高致死性以及流行范围不断扩大的趋势，该病已经成为全球的公共卫生问题。类鼻疽伯克霍尔德菌是一种革兰氏阴性杆菌，有极高的感染性和对环境的极强的抵抗能力，已被美国疾病控制和预防中心列为B类生物战剂。此外临床上类鼻疽杆菌感染的多重耐药菌性，使得其感染的治疗是异常困难。因此发展新的预防和治疗策略非常重要。疫苗是预防和控制感染性疾病有效、经济的手段。就类鼻疽杆菌疫苗研究而言，已经有很多研究就全菌灭活疫苗、成份疫苗、结合疫苗等方面进行了尝试，但目前还没有一种应用于临床。重组亚单位疫苗是通过重组表达能够有效刺激机体产生具有保护性免疫反应的抗原分子(主要是蛋白抗原)，从而达到预防和控制疾病的目的。亚单位疫苗因为其成份清楚、质量可控、成本较低，已经成为新型疫苗发展的重要方向。鞭毛蛋白(flagellin, flic)作为细菌表面主要抗原，其氨基酸序列高度保守，是引起免疫反应的重要抗原成份之一，已广泛用于该细菌感染的诊断，并可作为亚单位疫苗的候选抗原成份。本文分别采用pET22b、pET28a以及pGEX载体进行flic的表达，结果均不理想。课题组前期在研究肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7的Ⅲ型分泌系统重要元件(Escheriochia coli secret protein A，EspA)的功能时发现其具有促进外源蛋白表达的作用，并构建了基于EspA的表达载体pEspA。本研究拟采用该表达系统重组表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白flic与EHEC O157:H7EspA融合蛋白，并评价其免疫学性质，为发展针对类鼻疽杆菌和EHEC O157:H7的二联疫苗奠定基础。方法1bpsl3319基因的克隆和重组表达质粒的构建以类鼻疽杆菌BPC006基因组DNA为模板，PCR扩增flic编码基因bpsl3319，通过DNA重组技术连接到不同表达质粒pET22b(+)、pET28a (+)、pGEX和pEspA，酶切后测序鉴定阳性重组子，转入大肠杆菌BL21，获得重组表达工程菌。2重组蛋白EspA-flic的表达和纯化重组工程菌pEspA-flic经IPTG诱导剂诱导后，超声破菌，SDS-PAGE电泳分析重组蛋白EspA-flic表达形式。EspA-flic融合蛋白经过包涵体洗涤、使用阴离子交换层析和凝胶过滤层析，纯化后产物超滤离心浓缩，采用BCA法测定蛋白浓度。3融合蛋白EspA-flic免疫学性质研究3.1融合蛋白的反应性检测Western blot检测融合蛋白与类鼻疽杆菌多抗和EspA单克隆抗体、EspA多抗免疫反应性。3.2融合蛋白的免疫原性检测纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠，ELISA方法检测血清特异性抗体的滴度；并通过Western blot检测免疫血清与类鼻疽杆菌全菌、融合蛋白及EspA的反应性。结果1成功克隆了类鼻疽杆菌flic编码基因bpsl3319，并构建了重组表达质粒pET22b-bpsl3319、pET28a-bpsl3319、pGEX-bpsl3319和pEspA-bpsl3319，flic在前三种表达系统中未见明显表达，仅在pEspA系统获得高效表达。2重组工程菌pEspA-flic/BL21经过IPTG诱导后，融合蛋白EspA-flic表达量约占菌体总蛋白的35％，纯化后蛋白纯度大于85％。3EspA-flic能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EspA的单抗或多抗血清发生特异性抗原抗体反应，表现出良好的免疫反应性。4EspA-flic免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG，而且此抗体能识别EspA-flic、EspA以及天然类鼻疽杆菌的flic，表现出良好的免疫原性。结论本研究采用DNA重组技术成功表达了具有良好免疫原性和免疫反应性的类鼻疽杆菌鞭毛蛋白flic与肠出血性大肠杆菌EspA的融合蛋白，为研制类鼻疽杆菌和肠出血性大肠杆菌O157：H7的二联疫苗奠定了基础。

关键词：类鼻疽伯克霍尔德杆菌鞭毛蛋白flic 肠出血性大肠杆菌O157 H7 EspA 融合蛋白疫苗

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马流产沙门氏菌新疆分离株鉴定免疫及其flic蛋白增强SeM蛋白及gD蛋白抗体应答的研究

马流产沙门氏菌新疆分离株鉴定免疫及其FliC蛋白增强SeM蛋白及gD...

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作者：杨康新疆农业大学

学位级别：硕士

马流产沙门氏菌可引起妊娠母马流产,幼驹败血症,下痢,公马睾丸炎,髯甲脓肿。该病可给马养殖业造成严重经济损失。本研究首先对新疆地区养马较为集中的昭苏县、富蕴县、特克斯县、和静县、吉木乃县的养殖场(户)的2768份马血清样品进行马... 详细信息

马流产沙门氏菌可引起妊娠母马流产,幼驹败血症,下痢,公马睾丸炎,髯甲脓肿。该病可给马养殖业造成严重经济损失。本研究首先对新疆地区养马较为集中的昭苏县、富蕴县、特克斯县、和静县、吉木乃县的养殖场(户)的2768份马血清样品进行马流产沙门氏菌血清学调查。间接ELISA法检测结果显示,这5县马养殖场(户)中马流产沙门氏菌病抗体平均阳性率为28.68%;雌性马匹的抗体阳性率(36.9%)略高于雄性马匹(29.7%),但差异不显著;吉木乃和和静县马匹抗体阳性率相对较低,为3.24%-9.78%,特克斯县和昭苏县抗体阳性率相对较高,为27.17%～43.91%;从年龄统计结果来看,各年龄段的的马匹均有一定的抗体阳性率。本研究从流产马匹的病料中分离纯化,并经生化和PCR鉴定得到马流产沙门氏菌新疆分离株。本研究进一步利用分离菌株的基因组,经PCR扩增得到了马流产沙门氏菌鞭毛蛋白基因flic2,大小为1427 bp,并构建重组质粒pET28a-flic2,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析该重组蛋白大小约为52KDa,Western-blotting分析显示该蛋白具有反应原性。将纯化后的融合蛋白F1iC2免疫小鼠,检测结果显示,免疫小鼠中产生了较高水平的抗体,抗体效价可达1：218 700,且以IgG1亚型为主。将纯化后的融合蛋白免疫马匹,免疫马血清中同样产生了较高水平的特异性抗体,抗体效价可达1：72 900。本研究进一步利用PCR扩增了截短的马流产沙门氏菌鞭毛蛋白基因flicl,大小为840 bp,并构建重组质粒pGEX-flic1。诱导表达的融合蛋白flicl-GST经SDS-PAGE电泳分析大小为56 KDa。将纯化后的flic1蛋白和本实验室已表达的gD蛋白联合免疫马匹,结果表明,两种蛋白联合免疫组马血清中抗体水平高于这两种蛋白单独免疫组,抗体效价可达1：218 700。检测结果还表明,flic1蛋白可促进gD蛋白免疫水平的升高。且产生的抗体以亚型IgG1为主。对抗体持续期的检测表明抗体维持较高水平可达170 d。为比较flic两个不同大小片段免疫效果的差异,本研究将flic1和flic2分别与SeM蛋白联合免疫C57BL/6小鼠,对免疫小鼠抗体的效价、抗体亚型以及攻毒保护力评估不同大小鞭毛蛋白对SeM蛋白免疫效果的影响。结果显示,flic2与SeM联合免疫组产生的抗体效价更高,抗体主要以IgG1为主;对小鼠的攻毒保护率最高,可达80%。该结果表明,鞭毛蛋白flic2对SeM辅助免疫效果比flic1更好。该结果对我们更好地利用flic蛋白进行相关研究奠定实验基础。

关键词：马流产沙门氏菌鞭毛蛋白flic 表达纯化 SeM蛋白 gD蛋白联合免疫

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布鲁氏菌flic影响巨噬细胞基因表达谱的初步研究

布鲁氏菌fliC影响巨噬细胞基因表达谱的初步研究

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作者：聂鑫海南大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病是在世界广泛流行的传染性人畜共患病。布鲁氏菌是其致病菌,革兰氏染色为阴性,属于胞内菌。鞭毛蛋白flic是布鲁氏菌鞭毛丝的主要组成部分,参与细菌对宿主的致病过程,是重要的病原相关分子模式之一（PAMPs）。有研究将缺失fli... 详细信息

布鲁氏菌病是在世界广泛流行的传染性人畜共患病。布鲁氏菌是其致病菌,革兰氏染色为阴性,属于胞内菌。鞭毛蛋白flic是布鲁氏菌鞭毛丝的主要组成部分,参与细菌对宿主的致病过程,是重要的病原相关分子模式之一（PAMPs）。有研究将缺失flic基因后的布鲁氏菌通过腹腔注射感染小鼠,发现其毒力增强。但flic缺失株感染后引发宿主细胞基因表达的变化机制还有待研究。本研究利用PCR技术及T4 DNA连接酶,通过重叠延伸PCR反应及T4 DNA连接酶连接平末端,成功构建同源重组质粒pGEM-7Zf（+）-Δflic。然后利用电转化手段将该重组质粒转化到布鲁氏菌M5-90株,通过PCR验证及连续传代确定其遗传稳定性,最终成功获得M5-90-Δflic基因缺失株。将布鲁氏菌M5-90与布鲁氏菌M5-90Δflic缺失株分别感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,TRIzol法提取总RNA。应用miRNA Microarray-Single芯片检测miRNAs表达谱变化,通过Agilent芯片检测基因表达谱变化。芯片实验结果发现了 15个差异倍数≥2的miRNAs及388个差异倍数≥2的mRNAs。经qRT-PCR验证后,发现10个下调的miRNAs表达量变化与芯片结果一致,分别为:mmu-miR-6965-3p、mmu-miR-328-5p、mmu-miR-7683-3p、mmu-miR-7072-5p、mmu-miR-691、mmu-miR-3070-2-3p、mmu-miR-7056-5p、mmu-miR-1907、mmu-miR-486a-3p、mmu-miR-409-3p。利用TargetScan和miRDB数据库对差异miRNA及差异mRNA表达谱进行联合分析,发现39个靶基因,再经qRT-PCR验证后,确认38个靶基因表达量与芯片结果一致,并且最终预测得到80对miRNA与靶基因的对应关系。之后选取与免疫、细胞凋亡相关基因:白细胞介素17受体Il17ra、卷曲蛋白Fzd7和促凋亡蛋白Bmf基因为研究对象。根据预测的miRNA-mRNA关系,利用miRNAmimics转染RAW264.7,通过qRT-PCR验证确定miRNAs与靶基因的对应关系,结果初步得到miRNA-预测靶基因的对应关系mmu-miR-7056-5p与Bmf、mmu-miR-328-5p与Bmf、mmu-miR-691 与Il17ra、mmu-miR-328-5p 与Fzd7。本研究为发现flic在布鲁氏菌感染RAW264.7过程中的作用提供理论支持。

关键词：布鲁氏菌鞭毛蛋白flic RAW264.7 miRNAs-mRNAs 联合表达分析 Il17ra Fzd7 Bmf

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