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饲料研究 2023年第4期46卷 69-74页

作者：李双杨泽敏廖义潇杨颖贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025 贵州省动物生物制品工程技术研究中心贵州贵阳550025

试验旨在分析鞭毛蛋白刺激机体基因表达谱的特征,揭示鞭毛蛋白佐剂的作用机制。从GEO数据库筛选目标微阵列GSE46421和GSE72016及其差异表达基因(DEGs),经DAVID分析DEGs参与的GO功能注释和KEGG信号通路、String构建DEGs的蛋白质-蛋白质... 详细信息

试验旨在分析鞭毛蛋白刺激机体基因表达谱的特征,揭示鞭毛蛋白佐剂的作用机制。从GEO数据库筛选目标微阵列GSE46421和GSE72016及其差异表达基因(DEGs),经DAVID分析DEGs参与的GO功能注释和KEGG信号通路、String构建DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络、Cytoscape可视化PPI网络并筛选高连通度的PPI子模块和hub基因。结果显示,共筛选出182个DEGs,包含上调基因161个、下调基因121个。DEGs参与GO生物过程主要有信号转导、免疫应答、炎症反应、细胞凋亡等,参与分子功能包含激酶激活、受体结合、细胞因子激活、膜信号转导。DEGs参与KEGG通路涵盖细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路等免疫相关途径。分析DEGs的PPI网络发现,2个重要的PPI子模块和10个关键基因(IL-10、IL-6、CCL2、CXCL2、NFKBIA、MyD88等)。研究表明,鞭毛蛋白通过识别TLR5和NOD样受体,触发MyD88依赖性和MyD88非依赖性途径发出信号,激活转录因子NF-κB,这些信号通过级联反应激活机体免疫系统、诱导机体产生多种细胞因子和趋化因子,发挥佐剂效应。

关键词：鞭毛蛋白佐剂 GO分析 KEGG分析 PPI分析 hub基因

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新型冠状病毒S1蛋白在水稻中的表达及其免疫原性研究

新型冠状病毒S1蛋白在水稻中的表达及其免疫原性研究

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作者：温亚亚扬州大学

学位级别：硕士

新型冠状病毒感染(Coronavirus disease 2019,COVID-19)的暴发和全球蔓延,促使全球科学界致力于新型保护性疫苗的研发。新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)表面的刺突蛋白(Spike,S)可被宿主蛋白酶切割成S1和S2亚基,其中S1亚基,可诱导中和抗体的产生,是新冠亚单位疫苗研究的重要靶点。与传统表达系统相比,利用水稻生物反应器表达抗原蛋白生产亚单位疫苗具有生产成本低、易规模化生产、不携带动物源性病原、储存简单等优势,具有良好的发展前景。但是亚单位疫苗通常免疫原性较低,需要添加佐剂提高其免疫应答的能力。鞭毛蛋白是一种Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)5配体,其佐剂活性不断在多种病原上得到验证。因此,本研究通过构建转基因植物表达载体,筛选获得表达新型冠状病毒S1蛋白的转基因水稻纯合系,并对水稻源S1蛋白进行纯化。添加鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(FliC)作为佐剂,利用小鼠模型评价水稻源S1蛋白的免疫原性,探索其作为新冠亚单位候选疫苗的潜力,以期为研制经济、安全、有效的新冠疫苗提供新思路。1.植物表达载体的构建与S1转基因水稻纯合系筛选鉴定本章通过同源重组技术,分别构建含有新型冠状病毒S1基因的植物双元转化质粒pCAMBIA1300-Gt1-S1和pC1300-Actin-3Flag-S1,通过农杆菌转化法将重组质粒转入水稻愈伤组织中,发苗培养后获得转基因水稻T0代植株,其中pGt1::S1转基因水稻 30 株(1M3461-1M3490),pActin::S1 转基因水稻 26 株(1M3491-1M3516)。将其继续种植获得T1代转基因水稻56个系,通过PCR、qRT-PCR和Western blotting对S1蛋白表达情况进行鉴定。结果显示,S1蛋白在pGt1::S1转基因水稻种子中成功表达,而在pActin::S1转基因水稻种子和叶片中均未表达。因此后续针对pGt1::S1转基因水稻继续研究,选择其中表达量较高的1M3464、1M3468、1M3471、1M3473和1M3489这5个植株系的单株继续种植获得T2代植株。同样对获得的20个pGt1::S1 T2代转基因水稻植株系(2B2507-2B2526)进行PCR和Western blotting验证,并且使用PNGase F糖苷酶分析种子中S1蛋白糖基化现象,结果显示S1经过去糖基化酶处理后接近预期大小,表明蛋白在水稻胚乳中表达后发生了 N-糖基化修饰。质谱分析进一步说明S1蛋白在水稻中成功表达。选择T2代S1蛋白表达量高的植株进行大量种植,PCR结果显示已成功获得6个pGt1::S1 T3代转基因水稻纯合系(2C804-2C809),其中纯合植株系2C809的S1基因转录水平表达最高,拷贝数达到1.12×106 copies/μL。蛋白鉴定结果与此一致,2C809植株系S1蛋白表达量最高,每克种子中含265微克。综上,本研究成功获得了稳定表达S1蛋白的转基因水稻纯合系。2.水稻源S1蛋白的纯化及免疫原性分析本章通过Q阴离子柱对水稻源S1蛋白进行纯化,通过Western blotting鉴定其与兔源抗S-RBD多抗的反应性,以及与ACE2蛋白的亲和活性。结果显示,水稻源S1蛋白可以与S-RBD抗体发生强烈的特异性反应,并且与ACE2蛋白具有较高亲和力,表明S1蛋白具有良好的免疫反应性和完整的天然构象。以6-8周龄BALB/c雌性小鼠为模型,通过腹腔注射的方式免疫纯化后水稻源S1蛋白,免疫剂量为20 μg/只,并设置鞭毛蛋白FliC佐剂免疫组(S1+FliC)和Alum佐剂免疫组(S1+Alum)。在二免和三免后12天进行采血检测抗体应答水平,三免后14天制备小鼠脾脏淋巴细胞检测细胞免疫应答。结果显示,与S1免疫组相比,S1+FliC、S1+Alum免疫组的IgG抗体水平和中和抗体水平均显著升高。S1+FliC免疫组脾脏淋巴细胞在特异性抗原S1刺激下,细胞增殖水平显著提高。同时对S1蛋白引起的免疫类型进行鉴定,ELISpot(IFN-γ和IL-4)、细胞因子(Th1型细胞因子IFN-y、TNF-α和Th2型细胞因子IL-4、IL-10)及IgG亚型(IgG1和IgG2a)检测结果显示,与S1免疫组相比,S1+FliC免疫组IFN-y、TNF-α、IL-4和IL-10的表达水平、IgG1和IgG2a抗体水平均显著升高;而S1+Alum免疫组的IL-4、IL-10表达水平和IgG1抗体水平显著上调,但IFN-γ与S1免疫组相比无显著差异。表明水稻源S1蛋白在小鼠体内诱导Th1/Th2混合免疫应答,FliC可促进其诱导Th1/Th2混合免疫应答的能力,而Alum主要促进Th2型免疫应答。综上所述,本研究获得了高纯度的水稻源S1

关键词： SARS-CoV-2 转基因水稻 S1蛋白亚单位疫苗鞭毛蛋白佐剂

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新型冠状病毒肺炎非抗性DNA疫苗的构建与免疫原性研究

新型冠状病毒肺炎非抗性DNA疫苗的构建与免疫原性研究

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作者：汪巧菊扬州大学

学位级别：硕士

由新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019,COVID-19）已发展成为全球大流行的疾病,对人类生命健康和社会经济发展都造成了巨大损失,接种疫苗... 详细信息

由新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019,COVID-19）已发展成为全球大流行的疾病,对人类生命健康和社会经济发展都造成了巨大损失,接种疫苗是当下最经济有效的疫情防控措施之一。目前全球疫苗的研发方向包括灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组亚单位疫苗和核酸疫苗（DNA和mRNA疫苗）等。其中,DNA疫苗只包含编码抗原的遗传密码,具有便于开发和优化、适合快速大批量生产、方便贮存和运输等优点。但是,DNA疫苗的免疫原性通常较弱,并且当前处于临床研究的该种疫苗均使用的是含抗生素耐药基因作为筛选标志的载体,存在水平传播抗性基因的潜在风险。本研究使用实验室前期开发的非抗性筛选载体asd-pVAX1以提高DNA疫苗的安全性,同时将改良的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白佐剂（FliCΔD2D3）与候选抗原S1基因进行融合,进一步提升其免疫原性。由此,开发了新型的非抗性DNA候选疫苗,以期为COVID-19 疫苗的研制提供新思路。1.SARS-CoV-2 S1蛋白的原核表达及鉴定本研究利用PCR技术扩增SARS-CoV-2的S1基因序列,通过同源重组法将目的片段克隆至冷休克表达载体pCold I,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞内;诱导表达S1蛋白,经Ni2+柱亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白的表达情况。结果表明,已成功表达含His标签的S1蛋白,并且已获得浓度和纯度较高、能与抗S1蛋白多克隆抗体反应的目的蛋白。此外,使用S1蛋白刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,能诱导多种细胞因子（IL-1β和TNF-α）及趋化因子（MIP-2和IP-10）的表达,促进细胞产生免疫反应。综上,本研究成功构建了重组菌BL21（pCold I-S1）,获得了 SARS-CoV-2的良好候选抗原S1蛋白。2.COVID-19非抗性DNA疫苗的构建与鉴定本研究利用PCR技术分别扩增S1基因和S1-fliCΔD2D3基因序列,克隆至非抗性筛选真核表达载体asd-pVAX1,转化至大肠杆菌X6212（asd-）感受态细胞中,成功构建了 asd-pVAX1-S1和asd-pVAX1-S1-fliCΔD2D3重组质粒。经琼脂糖凝胶电泳鉴定,质粒完整性良好。通过脂质体转染HEK293T细胞,24 h后收集细胞样品,结合间接免疫荧光和Westernblotting鉴定目的蛋白的表达情况。结果显示,使用抗RBD蛋白多克隆抗体孵育后,asd-pVAX1-S1和asd-pVAX1-S1-fliCΔD2D3转染组的细胞中均可以观察到明显的绿色荧光,Westernblotting结果也显示重组质粒转染组均有明显的目的条带。此外,asd-pVAX1-S1-fliCΔD2D3转染组能与抗FliC蛋白单克隆抗体发生结合反应,产生明显的荧光和特异性条带。以上结果表明S1蛋白和S1-FliCΔD2D3蛋白均可以在细胞中表达,且具有良好的免疫反应性。综上,本研究成功获得了 COVID-19非抗性DNA候选疫苗 asd-pVAX1-S1 和 asd-pVAX1-S1-fliCΔD2D3。3.非抗性DNA疫苗的免疫原性评价将asd-pVAX1-S1和asd-pVAX1-S1-fliCΔD2D3重组质粒以肌肉注射的途径免疫BALB/c小鼠,分别在第14天和28天进行加强免疫,免疫剂量为100 μg/只,并设立PBS和asd-pVAX1免疫组作为对照。在二免12天、三免12天及第4、6、8、10、12周分别采血,通过间接ELISA检测小鼠血清中的抗体水平。结果显示,三免12天,与asd-pVAX1 组相比,asd-pVAX1-S1 和 asd-pVAX1-S1-fliCΔD2D3 均可以有效诱导机体产生IgG、IgG1和IgG2a抗体,且含FliCΔD2D3佐剂的免疫组的抗体水平显著高于单独S1基因免疫组;三免后4到12周,asd-pVAX1-S1-fliCΔD2D3免疫组血清中的IgG抗体有所降低,但始终维持在一个相对稳定的水平,并且显著高于asd-pVAX1-S1组。同时,假病毒中和试验的结果表明,asd-pVAX1-S1-fliCΔD2D3诱导机体产生的中和抗体水平显著高于单独S1基因免疫组,中和滴度平均达141左右。另外,在三免3周制备小鼠脾脏淋巴细胞,通过qRT-PCR检测细胞因子的表达水平。结果显示,asd-pVAX1-S1-fliCΔD2D3免疫组的Th1型细胞因子（IFN-Δ和TNF-α）及Th2型细胞因子（IL-4和IL-6）均显著上调,明显高于asd-pVAX1-S1免疫组,这与IgG亚型检测结果一致,表明构建的DNA疫苗可以诱导机体的Th1/Th2混合型免疫应答。本研究为进一步研制安

关键词： SARS-CoV-2 S1基因非抗性DNA疫苗鞭毛蛋白佐剂免疫原性

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基于流感病毒M2蛋白胞外区的双层蛋白质纳米颗粒的制备及免疫学效果评价

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国际流行病学传染病学杂志 2023年第6期50卷 378-385页

作者：马淑敏项婷婷何泳愉郭潮潭杨灿杨新燕胡珂昕沃恩康杭州医学院检验医学院、生物工程学院杭州310013

目的通过两步脱溶剂-交联法制备携带流感病毒血凝素茎部α螺旋区(HAα)、6个串联重复的M2蛋白胞外域(6M2e)和鞭毛蛋白(Flg)的双层蛋白质纳米颗粒, 探究其在小鼠体内的免疫效果。方法采用脱溶剂-交联法将融合蛋白FljB-6M2e-△D2D3-HAα... 详细信息

目的通过两步脱溶剂-交联法制备携带流感病毒血凝素茎部α螺旋区(HAα)、6个串联重复的M2蛋白胞外域(6M2e)和鞭毛蛋白(Flg)的双层蛋白质纳米颗粒, 探究其在小鼠体内的免疫效果。方法采用脱溶剂-交联法将融合蛋白FljB-6M2e-△D2D3-HAα和HAα-6M2e制备成双层蛋白质纳米颗粒。通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析仪进行物理表征后评估其细胞毒性。免疫小鼠后采用ELISA方法进行特异性抗体效价测定, ELISPOT检测细胞免疫水平, CCK-8法检测脾细胞的增殖情况。结果本研究成功制备了粒径为(130.03±2.96) nm的双层蛋白质纳米颗粒FljB-6M2e-△D2D3-HAα/ HAα-6M2e。免疫小鼠后产生的抗M2e-IgG抗体效价为1∶25 600, 抗HAα-IgG抗体效价为1∶12 800, 高于对照组小鼠, 差异均具有统计学意义(t=3.051和3.780, P=0.038和0.019)。与对照组相比, 多肽刺激可以使小鼠脾细胞显著增殖[M2e刺激增殖率:(154.18±2.34)%, HAα刺激增殖率:(151.51±1.56)%](t=12.942和24.591, P均蛋白质纳米颗粒可以刺激小鼠产生较高水平的体液和细胞免疫应答, 为开发多表位流感通用疫苗提供了有效依据。

关键词：正黏病毒科流感病毒纳米疫苗鞭毛蛋白佐剂免疫原性

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