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代谢网络的化学信息学分析及在胡萝卜软腐欧文氏菌药物靶点筛选中的应用

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代谢网络的化学信息学分析及在胡萝卜软腐欧文氏菌药物靶点筛选中...

作者：嵇匆四川农业大学

学位级别：硕士

当大多数代谢物是小分子并且代谢反应过程基本上仍是化学反应的时候,我们推断代谢网络结构可能具有化学基础。化学在代谢进化中有何贡献,化学性质对代谢进化有何影响,这就激发我们使用化学信息学的方法对这个问题深入下去。代谢网络与... 详细信息

当大多数代谢物是小分子并且代谢反应过程基本上仍是化学反应的时候,我们推断代谢网络结构可能具有化学基础。化学在代谢进化中有何贡献,化学性质对代谢进化有何影响,这就激发我们使用化学信息学的方法对这个问题深入下去。代谢网络与其他生物网络和非生物网络一样都具有无标度性质,可以从进化上解释新增加代谢物为何优先选择那些连接度较高的代谢物。但是优先添加原则的分子机制仍然不明确。在网络扩展中,新代谢物是如何“知晓”哪个代谢物连接度更高?并且代谢网络相比较化学网络究竟有哪些区别?在设计网络时选择hub代谢物的评判标准是什么?这些问题仍然令人费解。另外,代谢网络拓扑结构的进化解释对于实践并未有直接的指导意义,基于代谢网络中拓扑性质与化学性质的相关性,本研究尝试将其应用到致病菌的药物靶点筛选中。在筛选完靶点之后,运用计算机辅助药物设计中的同源模建和分子对接,期望为致病菌的药物设计和生物活性测试提供新的参考信息。首先,使用代谢网络建模、网络可视化与图论分析以及化学信息学方法分别深入分析原核生物和真核生物的模式生物大肠杆菌、酿酒酵母以及基于KEGG整体的代谢网络,由代谢物拓扑性质与化学性质的相关性研究验证代谢网络结构具有一个化学基础,探索代谢网络中hub代谢物区别于非hub代谢物所具备的特殊性质。生命源于水环境,早起源代谢物大部分都是分子较小,亲水性较高的。随着物种的进化,越来越多的复杂膜系统进化出来,这就需要疏水性代谢物完成细胞内和细胞外的交流。因而在新陈代谢的进化过程中,代谢物从亲水到疏水,从小体积到大体积的演变,都明确地说明了大肠杆菌、酿酒酵母以及生物整体新陈代谢的化学进化过程。其次,结合大肠杆菌和酿酒酵母代谢物的浓度数据,发现代谢网络结构所具有的化学基础可以由hub代谢物驱动各种反应所需要的高浓度来解释,代谢物浓度是决定代谢网络延伸的重要因素。这就从分子水平上重新解释了代谢网络满足的优先添加原则。另一方面,通过代谢网络与化学网络hub代谢物的比较分析发现,代谢网络相比化学网络,其hub代谢物平均具有更强的亲水性。因而在不同类型的网络设计中必须考虑环境,环境的极性与非极性性质决定了选用亲水还是疏水性分子作为hub代谢物,希望可以为代谢网络的设计提供一定的参考依据。最后,基于代谢网络中拓扑性质与化学性质的相关性,结合胡萝卜软腐欧文氏菌代谢网络中拓扑性质Degree和化学性质AlogP两项指标,由最初已知DIGAP数据库中的44个靶点初步筛选出17个靶点,并且由在植物寄主中不存在、经实验验证的成功靶点、阻塞点代谢物等诸多条件进一步筛选靶点,最终确定murA作为胡萝卜软腐欧文氏菌的潜在靶点。运用计算机辅助药物设计中的同源模建和分子对接,期望为该致病菌的药物设计和生测试验提供新的参考信息。综上所述,本研究的创新点在于以下几点：在以往的代谢网络研究中,往往忽视了化合物作为网络节点所具有的化学性质,本文突出节点的化学性质有助于分析代谢网络的拓扑结构,网络研究不应该脱离研究对象的自身性质。首次发现拓扑性质与化学性质的相关性,验证了代谢网络所具有的化学基础,以及将相关性结论应用到致病菌靶点筛选的实际工作中;运用代谢物浓度与化学性质的相关数据,从分子水平上重新解释了代谢网络的优先添加原则;提出在不同类型的网络设计中需要考虑环境,环境的极性与非极性性质决定了选用亲水还是疏水性分子作为hub代谢物。

关键词：代谢网络化学性质拓扑性质优先添加原则靶点筛选

附子中单酯型生物碱类成分抗高血压作用的靶点筛选与确证

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附子中单酯型生物碱类成分抗高血压作用的靶点筛选与确证

作者：王菲山东中医药大学

学位级别：硕士

目的:明确附子中单酯型生物碱类成分的降压作用,筛选并确证其抗高血压作用靶点,为阐明单酯型生物碱类成分的药理作用机制提供依据。方法:采用SHR,通过股动脉有创测压法检测经股静脉瞬时给药三种单酯型生物碱后的大鼠血压变化,通过股动... 详细信息

目的:明确附子中单酯型生物碱类成分的降压作用,筛选并确证其抗高血压作用靶点,为阐明单酯型生物碱类成分的药理作用机制提供依据。方法:采用SHR,通过股动脉有创测压法检测经股静脉瞬时给药三种单酯型生物碱后的大鼠血压变化,通过股动脉有创测压法检测经胃管插管瞬时给药BAC后大鼠血压变化;其次利用在线高血压药物靶点智能分析平台筛选出潜在的药物降压作用靶点蛋白,利用Discovery Studio软件的模拟对接技术和SPR实验,对三种单酯型生物碱成分与靶点蛋白的结合进行验证;通过酶动力学实验体外验证单酯型生物碱类成分对靶蛋白的活性影响;通过股动脉有创测压法检测灌胃药物14天后大鼠血压变化,并采集血浆通过ELISA检测法测定RAAS系统相关成分的血清浓度。结果:通过股静脉瞬时给药BAC,SHR血压显著降低;股静脉瞬时给药BMC时,对降低SHR血压略有效果;而给药BHC时,大鼠血压无显著变化。通过股动脉有创测压法检测经胃管插管给药不同剂量BAC,高剂量BAC可以显著降低SHR血压,而中低剂量并无降压作用。通过药物靶点智能分析系统筛选出的一些作用靶点,主要有ACE、ACE2等。通过虚拟分子对接生物分析技术表明ACE、ACE2均与三个单酯型生物碱类成分有较好的结合。SPR体外实验进一步验证了三种生物碱成分与两个靶点的结合效果。动物体外酶动力学实验表明给药BAC可以抑制ACE酶活性,激动ACE2酶活性。通过股动脉有创测压法检测灌胃中高剂量BAC后,可以降低SHR血压,而灌胃给药低剂量时并无降压作用;高剂量BAC灌胃后采集血浆经ELISA检测,ACE的含量降低,ACE2的含量升高;中低剂量灌胃给药后采集的血浆中ACE、ACE2含量无显著变化。结论:附子中单酯型生物碱类成分可以降低SHR的血压,BAC通过共同靶向RASS系统的ACE-Ang II-AT1轴和ACE2-Ang(1-7)-Mas轴起到降低SHR血压的作用。

关键词：附子单酯型生物碱高血压靶点筛选靶点确证

人S100A6基因真核表达质粒的构建及RNA干扰靶点筛选

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人S100A6基因真核表达质粒的构建及RNA干扰靶点筛选

作者：孟英爽大连医科大学

学位级别：硕士

研究背景：胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，化疗是进展期胃癌最重要的治疗措施，然而，由于肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)的产生，常常导致化疗失败，因此，深入研究胃癌MDR形成的机制，从而采取RNA干扰、基因过表达等... 详细信息

研究背景：胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，化疗是进展期胃癌最重要的治疗措施，然而，由于肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)的产生，常常导致化疗失败，因此，深入研究胃癌MDR形成的机制，从而采取RNA干扰、基因过表达等方法逆转胃癌MDR，将有可能给胃癌基因治疗带来新的突破。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double strand RNA,dsRNA)诱发的序列特异的转录后基因沉默（PTGS）过程。期间，双链RNA被特异的核酸酶降解成小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，小干扰RNA与靶蛋白结合成RNA诱导的沉默复合物(siRNA-induced silencing complex，RISC)，RISC识别并降解靶mRNA，产生有效的基因沉默。RNA干扰技术具有相当高的特异性和高效性，并且操作简单、周期短、成本低。目前，该技术已成为研究基因功能、认识疾病本质的重要工具，将来更有望用于疾病的基因靶向治疗，具有相当广阔的临床应用前景。此前,本课题组以人胃癌细胞株SGC7901、阿霉素诱导的耐药细胞株SGC7901/ADR和丹参逆转后的耐药细胞株为研究对象，应用蛋白质组学技术对三者进行蛋白质组学的差异比较，并且通过高效液相色谱电喷雾电离飞行串联质谱对差异蛋白质进行鉴定，结果发现，S100A6在SGC7901中呈现高表达，在SGC7901/ADR中表达下调，在丹参逆转后的耐药细胞株中再次呈现高表达;并采用免疫细胞化学方法、Western blot方法和RT-PCR技术再次验证了S100A6的差异表达。本研究以S100A6高表达的人胃癌细胞株SGC7901为研究对象，运用RNA干扰技术，将构建S100A6-shRNA质粒载体并转染入SGC7901细胞，筛选有效的RNA干扰片段，为有效下调S100A6在SGC7901细胞中的表达，并进一步探讨S100A6与胃癌MDR的关系奠定基础。目的：构建人S100A6基因shRNA真核表达质粒，利用实时荧光定量PCR技术检测其对S100A6基因的沉默效果，筛选出最有效的RNA干扰靶点，为进一步研究S100A6与胃癌多药耐药奠定基础。方法：本课题依据Gene Bank中人S100A6基因序列，针对S100A6基因设计合成具有高特异性的四条shRNA干扰片段，同时设计一无关序列作为阴性对照(negative control，NC)。将各干扰片段及阴性对照与带有绿色荧光蛋白GFP及氨苄青霉素抗性的真核表达载体pRNAT-U6.1/GFP/Neo连接，阳性克隆鉴定及DNA测序鉴定重组质粒。用脂质体转染法将重组质粒转染到SGC7901细胞中，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况及转染效率。转染48小时后提取细胞总RNA，运用RT-QPCR技术进行检测，从而筛选出最有效的RNA干扰片段，确定最佳干扰靶点。结果：通过阳性克隆鉴定鉴定和DNA测序鉴定，成功构建四种针对S100A6的shRNA质粒及阴性对照质粒。将这五组质粒分别转染SGC7901细胞后，在荧光显微镜下均可观察到亮绿色荧光，得到转染效率为40%。转染后48小时提取细胞总RNA，荧光实时定量PCR检测四条shRNA真核表达质粒在mRNA水平对S100A6抑制率分别为31.3%、20.6%、27.9%、22%，说明四组质粒均可使S100A6基因的mRNA表达量下降，其中S100A6-1对S100A6基因在mRNA水平上的抑制作用最明显，抑制率为31.3%。四组质粒RNA干扰效率分别为78.25%、51.5%、69.75%、55%，其中S100A6-shRNA-1的干扰效率最高，为78.25%，说明S100A6-1为最佳筛选靶点。结论：1、人S100A6基因shRNA真核表达质粒能特异性抑制人胃癌细胞株SGC7901中S100A6基因mRNA水平的表达。 2、S100A6-shRNA-1真核表达质粒对S100A6基因mRNA水平的干扰效率最高且正确有效。 3、S100A6-1的靶点序列作为最佳筛选靶点，可以用于后续实验研究。

关键词： S100A6基因短发夹RNA 真核表达质粒 RNA干扰实时荧光定量PCR 靶点筛选

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mRNA靶点筛选方法研究进展

中国生物工程杂志 2003年第3期23卷 1-5页

作者：王全会毛建平北华大学医学院吉林132000 军事医学科学院放射医学研究所北京100850

mRNA靶点筛选问题是反义核酸领域的一个难题。近年来出现了多种筛选mRNA上可接近位点以确定靶位点的方法 ,包括mRNA实测分析法和计算机模拟分析两大类。其中mRNA实测分析法又包括多种针对自然折叠mRNA的实验分析技术 ;即基因walk技术 ,R... 详细信息

mRNA靶点筛选问题是反义核酸领域的一个难题。近年来出现了多种筛选mRNA上可接近位点以确定靶位点的方法 ,包括mRNA实测分析法和计算机模拟分析两大类。其中mRNA实测分析法又包括多种针对自然折叠mRNA的实验分析技术 ;即基因walk技术 ,RNaseH作图技术、寡核苷酸微阵列技术 ,酶作图法确定二级结构技术 ,核酶导向型随机RNA库位点筛选技术和随机寡核苷酸库结合逆转录位点筛选技术。这些方法在鉴定RNA可接近位点及反义核酸的设计方面均有重要作用。

关键词：靶点筛选研究进展 mRNA 反义核酸可接近位点

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薯蓣皂酮的微生物合成及其作用靶点筛选

薯蓣皂酮的微生物合成及其作用靶点筛选

作者：陈云丰华中科技大学

学位级别：硕士

薯蓣皂苷元是生产甾体激素药物的主要原料,也是一种重要的活性物质,具有抗肿瘤、抗炎等药理作用。以薯蓣皂苷元为底物生物转化能得到一系列活性化合物,薯蓣皂酮及其衍生物是其中重要的一类产物。薯蓣皂酮是哥伦比亚地区传统抗疟植物Sola... 详细信息

薯蓣皂苷元是生产甾体激素药物的主要原料,也是一种重要的活性物质,具有抗肿瘤、抗炎等药理作用。以薯蓣皂苷元为底物生物转化能得到一系列活性化合物,薯蓣皂酮及其衍生物是其中重要的一类产物。薯蓣皂酮是哥伦比亚地区传统抗疟植物Solanum nudum的主要活性成分,是一种天然抗疟化合物。现有抗疟药物面临抗药性的问题,迫使人们去开发新的抗疟药物。薯蓣皂酮具有和现有抗疟药物不同的碳骨架,但其作用机制尚不清楚,阐明薯蓣皂酮的作用靶点,有利于后续以其为母核开发活性更高的衍生物。天然薯蓣皂酮主要从少数茄科植物中提取,在植物组织中含量极低,限制了人们的开发和利用。从来源广泛的薯蓣皂苷元半合成薯蓣皂酮是合理的替代方案,生物转化具有环境友好、反应条件温和等优势,在甾体药物合成中被广泛应用。本论文通过筛选具有转化薯蓣皂苷元合成薯蓣皂酮能力的微生物,在优化转化条件的基础上,制备薯蓣皂酮,并对其活性靶点进行筛选,解决薯蓣皂酮来源受限的问题,为薯蓣皂酮的大量生产和应用开发奠定基础。取得的主要研究结果如下:(1)首次筛选得到一株具有催化薯蓣皂苷元合成薯蓣皂酮能力的土曲霉。从盾叶薯蓣内生菌和实验室保藏菌株中筛选得到6株具有较强薯蓣皂苷元转化能力的微生物,分别为小克银汉霉(Cunninghamella sp)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、少根霉(Rhizopus arrhizus)、白根霉(Rhizopus niveus)。结合TLC和LC-MS产物比对分析,发现土曲霉能将薯蓣皂苷元转化为目标产物薯蓣皂酮,其得率为16.43%。(2)对土曲霉转化合成薯蓣皂酮的条件进行优化,优化后薯蓣皂酮得率为28.32%,相对优化前提高了72.37%,使用优化条件进行制备,鉴定转化产物为薯蓣皂酮。对土曲霉转化薯蓣皂苷元合成薯蓣皂酮的条件进行单因素和正交优化,确定土曲霉转化薯蓣皂苷元的条件为:菌种培养3 d后,以2%无水乙醇预溶解薯蓣皂苷元投料,同时加入1‰的吐温80和400μM的2,2’-联吡啶,转化时间为3 d;该条件下薯蓣皂酮得率为28.32%,相对优化前的得率16.43%提高了72.37%,使用优化后的转化条件进行薯蓣皂酮制备,通过正相硅胶柱层析、重结晶、制备HPLC分离纯化,经LC-MS、NMR、IR鉴定确认产物为薯蓣皂酮。(3)使用虚拟筛选预测薯蓣皂酮的抗疟作用靶点和其它潜在靶点,验证薯蓣皂酮具有谷胱甘肽还原酶抑制活性,同时具有一定的抗肿瘤活性。通过Pharm Mapper反向预测和Autodock Vina分子对接,筛选得到了七个薯蓣皂酮潜在的抗疟作用靶点:谷胱甘肽还原酶,烯酰ACP还原酶,天冬氨酸蛋白酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,cAMP依赖型蛋白激酶调节亚基。体外实验验证薯蓣皂酮对谷胱甘肽还原酶有抑制作用,说明薯蓣皂酮具有治疗疟原虫抗性株的潜力。在抗疟作用靶点筛选的基础上,对薯蓣皂酮抗疟外的潜在作用靶点进行筛选,得到17个潜在的薯蓣皂酮作用靶点,涉及肿瘤、自身免疫性肝病、肺结核等疾病。通过MTT法评估薯蓣皂酮抗肿瘤活性,发现薯蓣皂酮在100μg/mL时对ID8、Hela、Panc-1、CT26、Huh-7等9种肿瘤细胞的增殖有抑制效果,对人宫颈癌细胞Hela和人肝癌细胞Huh-7的IC分别为107.2±5.67μg/mL和57.1±2.16μg/mL,表明薯蓣皂酮具有一定的抗肿瘤活性。本论文首次筛选到一株具有转化薯蓣皂苷元生产薯蓣皂酮能力的土曲霉,对其转化条件进行优化,薯蓣皂酮得率由16.43%提高到28.32%,提高了72.37%,在此基础上进行产物制备,鉴定产物为薯蓣皂酮。结合虚拟筛选研究薯蓣皂酮作用靶点,证实薯蓣皂酮对谷胱甘肽还原酶有抑制作用,对人宫颈癌细胞Hela和人肝癌细胞Huh-7的IC分别为107.2±5.67μg/mL和57.1±2.16μg/mL,表现出一定的抗肿瘤活性。

关键词：薯蓣皂酮土曲霉生物转化靶点筛选活性评价

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白杨素抗肥胖的作用靶点筛选及验证

白杨素抗肥胖的作用靶点筛选及验证

作者：梅杰广州中医药大学

学位级别：硕士

目的:肥胖是一种危害人类健康的世界性的疾病,其发病机制主要与代谢性慢性炎症相关,目前依然没有找到一种安全有效的药物能够治愈肥胖。中药木蝴蝶中提取的白杨素具有良好的抗肥胖功效,但作用靶点及机制仍不清楚。本研究利用蛋白质组学... 详细信息

目的:肥胖是一种危害人类健康的世界性的疾病,其发病机制主要与代谢性慢性炎症相关,目前依然没有找到一种安全有效的药物能够治愈肥胖。中药木蝴蝶中提取的白杨素具有良好的抗肥胖功效,但作用靶点及机制仍不清楚。本研究利用蛋白质组学及基因沉默筛选并验证白杨素抗肥胖的作用靶标,为其应用提供科学依据。方法:胰岛素诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,0.5mmol/L棕榈酸建立脂肪细胞肥大模型,以50umol/L白杨素进行干预;双向电泳分析正常组、模型组及白杨素组的差异蛋白,以液质联用质谱联合飞行时间串联质谱对差异蛋白进行鉴定,获得候选靶标蛋白;通过基因沉默、紫外光谱及荧光光谱分析确证白杨素抗肥胖的靶标蛋白。结果:棕榈酸组(模型组)中脂肪细胞内脂滴形成较正常组及白杨素组明显增加;双向电泳得到各组蛋白质谱后通过分析比较,得到在模型组中较正常组明显增高或降低2倍及以上的蛋白点(p筛选和验证,白杨素发挥抗肥胖的作用靶点是膜联蛋白A2和热休克蛋白60,其作用机制可能是白杨素分别对膜联蛋白A2/MAPK通路及热休克蛋白60/myd88通路发挥抑制作用,影响这两个炎症信号通路在脂肪细胞内的激活,从而发挥抗肥胖作用。

关键词：白杨素肥胖靶点筛选蛋白质组学基因沉默炎症

网络药理学在药物有效成分和疾病靶点筛选中的应用研究进展

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中国临床药学杂志 2024年第3期33卷 237-240页

作者：龚棋棋刘雪菲蒋红新疆医科大学护理学院乌鲁木齐830017 新疆医科大学第二附属医院乌鲁木齐830011 新疆区域人群疾病与健康照护研究中心乌鲁木齐830017

网络药理学为近年来发展的新兴学科,它融合了多个学科的前沿技术,系统地揭示了药物成分与疾病靶点、疾病与靶点蛋白、靶点蛋白与药物、药物与药物之间的关系,从网络层面的角度观察药物对疾病的影响,为疾病的机制探讨和治疗提供了新的方向。

关键词：网络药理学靶点筛选数据库

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天然抗氧化物拮抗胰岛素抵抗的分子靶点筛选

天然抗氧化物拮抗胰岛素抵抗的分子靶点筛选

第九届全国生物医学体视学学术会议、第十二届全军军事病理学学术会议、第八届全军定量病理学学术会议

作者：张桂珍郑锦花杜珍武吴玫宋旸张玉成吉林大学第二临床医学院研究中心吉林大学第二医院骨科医院骨科研究所吉林大学第一临床医学院哈尔滨医科大学四院病理科

目的:糖尿病分子发病机理的进展涉及了近百种基因的转录与翻译水平表达及其生物学作用的异常,尤其值得注意的是氧化侵袭作为糖尿病及其合并症发生发展的核心机制一直是近年来糖尿病研究领域关注的前沿问题之一。糖尿病是由遗传因素与环... 详细信息

目的:糖尿病分子发病机理的进展涉及了近百种基因的转录与翻译水平表达及其生物学作用的异常,尤其值得注意的是氧化侵袭作为糖尿病及其合并症发生发展的核心机制一直是近年来糖尿病研究领域关注的前沿问题之一。糖尿病是由遗传因素与环境因素共同作用引起的慢性退行性疾病,从胰岛β细胞受损至糖尿病发作经过较长时间的潜临床状态。针对糖尿

关键词：胰岛素抵抗分子靶点信号转导通路硫辛酸 resistin 靶点筛选天然抗氧化物

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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药物靶点筛选的研究

中国卫生产业 2013年第14期10卷 187-187,189页

作者：崔大明长春中医药大学吉林长春130117

新型药物的设计和筛选都是通过已知的靶点来完成的,因而对药物靶点的筛选就成为药物开发过程中的一个重要过程,靶点筛选的成功与否直接影响到后期药物的相关研究,所以,许多研究人员尝试各种方法提高靶点的筛选效率,目前,已经有很多比较... 详细信息

新型药物的设计和筛选都是通过已知的靶点来完成的,因而对药物靶点的筛选就成为药物开发过程中的一个重要过程,靶点筛选的成功与否直接影响到后期药物的相关研究,所以,许多研究人员尝试各种方法提高靶点的筛选效率,目前,已经有很多比较成熟的筛选方法,除此之外,新的筛选方法也在不断探索中。本文主要对目前药物靶点筛选过程做以总结,并简单概述筛选过程中应用到的方法。本文主要总结了药物靶点筛选的全部流程,并重点介绍了靶点确认及验证的成熟方法。

关键词：小分子靶点筛选靶点验证