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岗梅根中硫酸酯类化合物抗流感病毒靶标验证及其构效关系研究

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岗梅根中硫酸酯类化合物抗流感病毒靶标验证及其构效关系研究

作者：何秋燕广州中医药大学

学位级别：硕士

目的:评价岗梅根中新分离得到的硫酸酯类皂苷化合物Asprellcosides B抗流感病毒效果,且验证其抗流感病毒的作用靶标,并对岗梅根硫酸酯类化合物进行构效关系探讨。方法:1.以磷酸奥司他韦为阳性对照,采用CCK8及酶活实验(病毒表面神经氨酸... 详细信息

目的:评价岗梅根中新分离得到的硫酸酯类皂苷化合物Asprellcosides B抗流感病毒效果,且验证其抗流感病毒的作用靶标,并对岗梅根硫酸酯类化合物进行构效关系探讨。方法:1.以磷酸奥司他韦为阳性对照,采用CCK8及酶活实验(病毒表面神经氨酸酶活性)检测Asprellcosides B在预防给药、预混给药、同时给药、治疗给药4种给药模式下对H1N1流感病毒感染A549细胞病毒抑制作用,并检测Asprellcosides B对病毒感染不同细胞中流感病毒增殖的抑制作用及对不同亚型流感病毒抑制作用。2.建立细胞模型,利用酶活实验,考察H1N1流感病毒感染A549后,不同时间段(-2h～-1h,-1h～Oh,Oh～2h,2h～4h,4h～6h)加入 Asprellcosides B后流感病毒增殖情况,判断岗梅根硫酸酯类皂苷化合物抑制流感病毒增殖的时间阶段,为确定Asprellcosides B抗流感病毒靶标提供指导。3.利用分子对接及SPR技术确认Asprellcosides B抗流感病毒作用靶点。4.利用红细胞凝集阻抑实验及溶血实验验证Asprellcosides B抗流感病毒作用靶点。5.利用分子对接、SPR技术及体外细胞实验对16个五环三萜类化合物进行抗流感病毒活性考察。并将其活性与结构进行分析,对岗梅根硫酸酯类皂苷化合物的构效关系进行探讨。结果:*** B抗流感病毒效果评价结果:(1)Asprellcosides B对MDCK细胞和A549细胞未表现出明显毒性,其半数毒性浓度 TC50>250 μ M。(2)Asprellcosides B在同时给药模式和预混给药模式下对A549细胞具有较好抗H1N1流感病毒作用,其半数有效浓度IC50分别为35.46 μ M和58.84 μ M,治疗指数SI分别为7.05和4.25;而治疗给药和预防给药抗病毒作用不明显。(3)Asprellcosides B在A549细胞和MDCK细胞中均能有效抑制H1N1流感病毒,Asprellcosides B在MDCK细胞中抑制流感病毒的IC50为47.65 μ M,治疗指数SI为5.25。(4)Asprellcosides B在A549细胞中对H9N2流感病毒同样具有抑制效果,其半数有效浓度IC50为184.60 μ M,治疗指数SI为1.35。*** B抗流感病毒靶标筛选实验结果:(1)不同时间段加药实验结果显示,Asprellcosides B抗病毒效果与其作用时间有关,在病毒感染时加入Asprellcosides B能有效抑制病毒复制,在病毒感染后加入药物则效果不明显,提示Asprellcosides B抗流感病毒作用于病毒的吸附、进入宿主细胞阶段。(2)分子对接实验,得到Asprellcosides B分子与HA1、HA2结构均有结合;SPR实验结果显示,Asprellcosides B能与HA蛋白结合,且结合常数KD=7.44 μ M。*** B抗流感病毒靶标验证实验结果:(1)红细胞凝集阻抑实验结果显示,Asprellcosides B未能有效抑制流感病毒与红细胞的凝集作用。(2)溶血实验结果显示,Asprellcosides B能抑制流感病毒引起的红细胞溶血过程。4.岗梅根硫酸酯类化合物抗流感病毒构效关系探讨结果:(1)分子对接、SPR实验及体外细胞抗病毒活性考察实验结果均显示齐墩果酸、熊果酸母核不具有抗病毒活性,3-C位或28-C位被糖基取代后,活性增强,19-C位上有硫酸酯基取代的Asprellcosides B和19-C、3’-C位上均有硫酸酯基取代的Asprellcosides A 活性明显增强,且 Asprellcosides A 活性大于 Asprellcosides B的活性。结论:Asprellcosides B在A549细胞和MDCK细胞上均能有效抑制H1N1流感病毒的复制增殖,对H9N2亚型流感病毒同样具有抑制效果,而且同时给药模式下效果最优。其毒性TC50>250 μ M,为低毒有效的抗流感病毒潜在药物。在流感病毒复制周期的不同时间段加入Asprellcosides B考察其抗流感病毒作用,研究表明,Asprellcosides B抗病毒作用于病毒复制周期早期,靶标验证实验研究表明其抗病毒作用靶点为病毒HA(HA2)蛋白上,可能通过阻止HA2发生构象改变,抑制HA2介导的膜融合环节,从而达到抗病毒作用。对岗梅根硫酸酯类化合物构效关系探讨显示,五环三萜类化合物母核不具备活性,3-C,28-C位上经糖基修饰,可增强该类化合物活性,特别是19-C或3’-C位上经硫酸酯基修饰后,该类化合物活性更强,推测硫酸酯基是岗梅根硫酸酯类化合物的重要活性基

关键词：岗梅 Asprellcosides B 流感靶标验证硫酸酯类化合物

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核酸损伤AlkB修复酶靶标验证

核酸损伤AlkB修复酶靶标验证

中国化学会第30届学术年会-第二十八分会：化学生物学

作者：李琦杨财广新药研究国家重点实验室中科院上海药物所

核酸损伤AlkB修复酶包括大肠杆菌AlkB和人体内的ALKBH2和ALKBH3,通过氧化去甲基方式修复mA和mC损伤。AlkB和ALKBH3已经有抑制剂报道,但是均不能成为化学探针。我们用大黄酸(rhein)作为工具化合物,描绘了rhein抑制AlkB修复酶的抑制机理... 详细信息

核酸损伤AlkB修复酶包括大肠杆菌AlkB和人体内的ALKBH2和ALKBH3,通过氧化去甲基方式修复mA和mC损伤。AlkB和ALKBH3已经有抑制剂报道,但是均不能成为化学探针。我们用大黄酸(rhein)作为工具化合物,描绘了rhein抑制AlkB修复酶的抑制机理和作用路径。酶学试验验证了rhein对AlkB修复酶的抑制活性,且rhein不抑制甲基转移酶和糖苷化酶。甲磺酸甲酯(MMS)在核酸产生mA和mC,rhein使大肠杆菌和肿瘤细胞U87对MMS更加敏感。rhein加剧了由MMS导致的基因组上mC损伤累积。rhein和MMS的协同效果依赖于细胞内AlkB修复酶的丰度和活性。胞内热迁移试验表明rhein可以在细胞质环境中直接结合并稳定AlkB。AlkB-rhein复合物晶体结构揭示了抑制机理,rhein是α-酮戊二酸(2OG)竞争性抑制剂。所有结果均指向AlkB修复酶是rhein和MMS协同效应的靶点。我们首次报道了具有细胞可溯性的AlkB修复酶抑制剂,验证了rhein的胞内靶标。表明AlkB修复酶具有作为抗菌或抗肿瘤靶标的潜在价值。

关键词： AlkB修复酶 rhein 靶标验证协同效应烷化剂

来源： cnki会议评论

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药物靶标的发现与验证技术研究进展

时珍国医国药 2010年第10期21卷 2634-2636页

作者：黄娅琳国家林业局野生动植物物证鉴定中心江苏南京210046 中国药科大学江苏南京211198

药物靶标的发现和验证是新药研发的第一步,也是药物筛选及药物定向合成成败的关键因素之一。随着基因组学、蛋白组学、生物信息学的快速发展,以及RNA干扰、噬菌体展示等新兴技术的出现,药物靶标的发现和验证技术日新月异。该文综述了在... 详细信息

药物靶标的发现和验证是新药研发的第一步,也是药物筛选及药物定向合成成败的关键因素之一。随着基因组学、蛋白组学、生物信息学的快速发展,以及RNA干扰、噬菌体展示等新兴技术的出现,药物靶标的发现和验证技术日新月异。该文综述了在基因水平、转录水平、蛋白水平药物靶标发现和验证的各种技术的研究进展及其成功案例。

关键词：药物靶标靶标发现靶标验证

猪肌肉发育相关microRNA-1和microRNA-206的靶标鉴定

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猪肌肉发育相关microRNA-1和microRNA-206的靶标鉴定

作者：孙伟西北农林科技大学

学位级别：硕士

microRNA(miRNA)是一类进化保守的大小在18-25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA,广泛存在动植物体内,对机体的生长发育、衰老和死亡等生物过程起着重要的作用。研究表明microRNA在骨骼肌的生长发育过程中发挥着重要调控作用。本文以在... 详细信息

microRNA(miRNA)是一类进化保守的大小在18-25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA,广泛存在动植物体内,对机体的生长发育、衰老和死亡等生物过程起着重要的作用。研究表明microRNA在骨骼肌的生长发育过程中发挥着重要调控作用。本文以在骨骼肌中特异性表达的microRNA-1和microRNA-206为主要研究对象,筛选其靶标基因,并研究它们在猪骨骼肌发育中的作用。本研究的主要结果如下： 1.利用TargetScan和PicTar等生物信息学软件预测miRNA-1和miRNA-206的靶标基因,结果发现有258个候选靶标基因。利用DAVID数据库对258个候选靶标基因进行GO和KEGG pathway分析,筛选出与肌肉发育相关的分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)和分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)基因为miRNA-1和miRNA-206的共有的候选靶标基因作为本论文研究重点。 2.拼接猪SFRP1的mRNA序列,扩增SFRP1和SFRP2基因mRNA的3’UTR序列。以Psi-Check2作为骨架载体,构建Psi-Check2-SFRP1和Psi-Check2-SFRP2载体,与体外合成的miRNA-1mimics和miRNA-206mimics共转染PIEC细胞36h,并进行双萤光素酶检测。结果发现,SFRP1和SFRP2基因实验组的萤光素酶表达量比对照组均显著下调(P0.05),表明SFRPl基因的这个突变位点就是miRNA-1和miRNA-206的靶标结合位点。 4.由于SFRP1在PIEC细胞中表达量较低,体外扩增SFRP1的CDS区域,构建Psi-Check2-SFRP1CDS-SFRP13’UTR载体,与体外合成的miRNA-1mimics和miRNA-206mimics共转染PIEC细胞36h,收集细胞,检测SFRP1基因在RNA和蛋白质水平的表达。实时荧光定量PCR(real-time PCR)结果表明,实验组miRNA-1和miRNA-206的表达量与对照组没有显著差异(P>0.05);Western blot结果表明,实验组(转染SFRP1过表达载体和miRNA-1和miRNA-206minics)比对照组的SFRP1蛋白表达水平显著降低,表明SFRP1是miRNA-1和miRNA-206的共同靶标基因,且miRNA-1和miRNA-206主要在翻译水平下调SFRP1的表达。 5.利用real-time PCR方法,检测SFRP1和SFRP2基因在通城成年母猪组织(9个组织),以及通城猪(27个时间点)和长白猪(23个时间点)骨骼肌生长发育过程中的表达量。结果显示：SFRP1在肺、肾、小肠和胃中高度表达,在大肠、肝和脾中度表达,在心脏、背肌和腿肌中低度表达;SFRP2在胃、小肠、肺和大肠中表达较高,在背肌和腿肌中中度表达,在心和脾中则是低度表达。SFRP1和SFRP2基因在通城猪和长白猪胚胎期的骨骼肌的表达量均显著高于出生后的表达量,表明SFRP1和SFRP2基因可能主要参与骨骼肌初级和次级纤维的形成。SFRP1和SFRP2基因在通城猪和长白猪两个品种间肌肉发育过程中的表达模式并不完全一致,推测SFRP1和SFRP2可能与不同猪品种间的肌肉表型差异有关。

关键词： miRNA-1 miRNA-206 靶标验证 SFRP1 SFRP2

HILIC-MS/MS法测定人尿中内源性糖类化合物浓度

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药物分析杂志 2017年第6期37卷 1046-1055页

作者：刘峰朱帮杰李熙拓王彦成玉闫超上海交通大学药学院上海200240 华东师范大学化学与分子工程学院上海200241

目的:利用亲水色谱-质谱联用技术对人尿中15个内源性糖类化合物进行快速测定。方法:分别对色谱条件、质谱条件和样品前处理方法进行优化,最终以含内标的甲醇-乙腈(50∶50,v/v)为沉淀剂,按体积比5∶1加入到尿液中除杂,以含10 mmol·L^(-1... 详细信息

目的:利用亲水色谱-质谱联用技术对人尿中15个内源性糖类化合物进行快速测定。方法:分别对色谱条件、质谱条件和样品前处理方法进行优化,最终以含内标的甲醇-乙腈(50∶50,v/v)为沉淀剂,按体积比5∶1加入到尿液中除杂,以含10 mmol·L^(-1)醋酸铵的水-乙腈(95∶5,v/v)和含10 mmol·L^(-1)醋酸铵的乙腈-水(95∶5,v/v)为流动相,梯度洗脱,样品经ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱分离,在多反应监测(MRM)模式下,采用电喷雾离子化源、负离子扫描模式进行定量分析。结果:人尿中糖类物质线性关系良好,大部分糖类物质r>0.99,最低检测限在0.075~30 nmol·L^(-1)之间;日内、日间精密度范围分别为2.5%~7.6%和3.3%~7.3%,均小于15%;回收率范围为85.5%~115%;大部分化合物的基质效应在80%~120%之内,样品上清液4℃稳定性好,72 h内浓度变化范围为93.1%~106%,最终测得20例健康人尿液中各糖的含量分别为(平均值±标准误差):楝二糖(2 668.1±134.4)nmol·L^(-1),蔗糖(5 070.6±277.6)nmol·L^(-1),麦芽糖(15 214.5±442.5)nmol·L^(-1),麦芽三糖(849.7±42.6)nmol·L^(-1),葡萄糖(173 965.0±4 918.9)nmol·L^(-1),果糖(22 172.5±1 463.6)nmol·L^(-1),棉子糖(292.1±17.6)nmol·L^(-1),肌苷(2 083.5±93.4)nmol·L^(-1),腺苷(2 645.5±78.2)nmol·L^(-1),甘露糖醇(83 925.0±3 938.6)nmol·L^(-1),赤藓糖醇(375 805.0±12 094.6)nmol·L^(-1),阿拉伯糖醇(192 921.1±5 689.2)nmol·L^(-1),麦芽四糖、木糖和核糖均低于定量限(分别低于60、600和3 000 nmol·L^(-1))。结论:该方法能快速测定人尿液中15个内源性糖类化合物含量,对代谢组学后期的靶标验证、代谢机理研究等具有重要意义。

关键词：内源性代谢物质尿液样品糖类化合物靶标验证代谢组学亲水色谱串联质谱

miR-R-203在鸡成肌细胞中靶向抑制EIFEIF4E基因表达的研究

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中国家禽 2015年第8期37卷 6-11页

作者：罗文聂庆华张细权华南农业大学动物科学学院广东广州 510642 广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室广东广州510642

为了进一步研究和探索mi R-203在鸡骨骼肌发育中的作用,本研究通过对mi R-203进行靶标预测,发现真核起始因子4E(EIF4E)基因的3′UTR区存在mi R-203的潜在靶标位点。通过构建连接有EIF4E 3′UTR和靶位点突变的EIF4E 3′UTR-MUT的双荧光... 详细信息

为了进一步研究和探索mi R-203在鸡骨骼肌发育中的作用,本研究通过对mi R-203进行靶标预测,发现真核起始因子4E(EIF4E)基因的3′UTR区存在mi R-203的潜在靶标位点。通过构建连接有EIF4E 3′UTR和靶位点突变的EIF4E 3′UTR-MUT的双荧光素酶靶标验证载体,将其分别转染到已过表达mi R-203或阴性对照鸡的DF-1细胞中,检测其中的荧光素酶活性。结果显示,mi R-203能显著抑制EIF4E 3′UTR载体的荧光素酶活性,但不影响EIF4E 3′UTR-MUT载体的荧光素酶活性,mi R-203能靶向调控鸡EIF4E的表达,研究结果为深入分析miR-203在鸡骨骼肌中的功能和作用机制奠定基础。

关键词： miR-203 靶标验证成肌细胞蛋白质合成

鸡miRNA lleett-7b靶向调控GHR基因的双荧光素酶验证

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中国家禽 2019年第5期41卷 11-15页

作者：刘咸刘燊岳孝亭张绮琼陈裕琪许嘉慧邓桃球林树茂佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528231

miRNA是一类大小约为22 nt的内源性非编码小RNA,通过与其靶基因mRNA相结合而影响其功能,进而调控动物的生长发育过程。miRNA靶基因预测软件发现,生长激素受体(GHR)基因是miRNA let-7b的候选靶基因之一。GHR基因作为生长激素基因的受体基... 详细信息

miRNA是一类大小约为22 nt的内源性非编码小RNA,通过与其靶基因mRNA相结合而影响其功能,进而调控动物的生长发育过程。miRNA靶基因预测软件发现,生长激素受体(GHR)基因是miRNA let-7b的候选靶基因之一。GHR基因作为生长激素基因的受体基因,在鸡的生长发育过程中具有极其重要的作用。试验采用双荧光素酶报告系统对其靶向关系进行验证。结果表明:GHR mRNA 3′UTR存在与let-7b相结合的靶标位点(UACCUCA);Let-7b过表达载体与GHR验证载体共转染组的荧光素酶相对活性只有0.159,明显下降,表明miRNA let-7b靶向负调控GHR 3′UTR,存在确切的靶标关系。研究结果可为进一步揭示let-7b介导GHR基因在鸡生长发育过程中的调控作用提供参考。

关键词：鸡 let-7b GHR 双荧光素酶靶标验证

鸡miRNA-205b靶向调控CD24基因的双荧光素酶验证

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中国家禽 2020年第12期42卷 25-29页

作者：张丹梦蔺文成刘满清庞燕玲江锦淇吴寒习罗庆斌华南农业大学动物科学学院广东广州510642 广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室广东广州510642 不详

miRNA靶基因预测软件发现,热稳定抗原分子24(CD24)基因是miR-205b的候选靶基因,为了进一步研究miR-205b在鸡热应激中的作用,将CD24野生型、突变型(CD24-WT/MT)和miR-205b mimic及mimic NC共转染DF-1细胞后,检测双荧光素酶活性。结果显示... 详细信息

miRNA靶基因预测软件发现,热稳定抗原分子24(CD24)基因是miR-205b的候选靶基因,为了进一步研究miR-205b在鸡热应激中的作用,将CD24野生型、突变型(CD24-WT/MT)和miR-205b mimic及mimic NC共转染DF-1细胞后,检测双荧光素酶活性。结果显示:当共转染CD24-WT时,miR-205b mimic组显著的抑制荧光素酶的活性,而共转染CD24-MT时,mimic NC组和miR-205b mimic组差异不显著。表明miR-205b能够靶向CD24的3′UTR区域,抑制其表达,结果为深入分析miR-205b在鸡热应激中的功能和作用机制奠定基础。

关键词： miR-205b CD24 靶标验证热应激

microRNA-21对猪骨骼肌生长发育调控的研究

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microRNA-21对猪骨骼肌生长发育调控的研究

作者：梁如意南京农业大学

学位级别：硕士

在饲养条件一致前提下,猪产肉量的高低和肉品质主要取决于肌纤维的数量和横截面积,而猪的肌纤维数量在胚胎期间就已经固定,所以胚胎间骨骼肌的生长发育成为猪产肉数量和性状的一个重要因素。而骨骼肌的生长发育是个很复杂的生物学过程,... 详细信息

在饲养条件一致前提下,猪产肉量的高低和肉品质主要取决于肌纤维的数量和横截面积,而猪的肌纤维数量在胚胎期间就已经固定,所以胚胎间骨骼肌的生长发育成为猪产肉数量和性状的一个重要因素。而骨骼肌的生长发育是个很复杂的生物学过程,受到多种因素的调控,研究表明microRNA (miRNA)对其发挥重要调控作用。microRNA是一类具有调控功能的内源性非编码的小分子,其长约18～25个核苷酸,主要参与基因转录后水平的调控,对生物体的生长、发育、衰老和死亡等生物学过程都有着重要的作用。本课题组通过高通量测序,发现miR-21在猪胚胎骨骼肌发育过程中有差异表达,且在特定阶段存在丰富表达。鉴于miR-21在医学疾病中的重要作用意义和本课题的新发现,我们开展,miR-21对猪骨骼肌发育调控的研究,旨在为后期猪骨骼肌发育调控机理和猪的遗传育种相关研究提供参考信息。 microRNA通过调控靶基因表达而广泛参与体内众多生理和疾病过程,miR-21调控骨骼肌的发育也是同样的机理。我们运用生物信息学检索比较分析,确定候选靶基因TGFBI,设计引物,合成miR-21minics,克隆获得猪TGFBI基因的部分3’UTR,构建Psi-Check2-TGFBI3’UTR载体,转染PIEC和PK15细胞,检测萤光素酶活性。同时利用荧光定量PCR和Western blot等试验验证rniR-21在RNA和蛋白水平上的变化。结果发现转染miR-21minics组荧光素酶活性低于对照组,miR-21在RNA水平上抑制(?) TGFBI基因的表达,但差异不显著(P>0.05),同时在蛋白水平也发生了抑制现象,差异显著(P0.05)。由此推断TGFBI可能与猪骨骼肌生长发育及品种间肌肉表型差异有关,在miR-21的作用下,调控骨骼肌的生长发育。

关键词：猪 microRNA miR-21 TGFBI 靶标验证骨骼肌发育