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基于高通量测序的RNA信息解析技术

生命科学 2021年第3期33卷 267-280页

作者：黄钧鸿黄巧娟李斌杨建华中山大学生命科学学院

非编码RNA (noncoding RNA, ncRNA)占据真核生物转录组的绝大部分,在各种生理和病理过程中发挥重要作用。随着高通量测序技术的发展,人们利用RNA信息学技术解析到越来越多的非编码RNA的信息,并逐渐揭示其功能和作用机制。该文主要介绍... 详细信息

非编码RNA (noncoding RNA, ncRNA)占据真核生物转录组的绝大部分,在各种生理和病理过程中发挥重要作用。随着高通量测序技术的发展,人们利用RNA信息学技术解析到越来越多的非编码RNA的信息,并逐渐揭示其功能和作用机制。该文主要介绍非编码RNA及其靶标鉴定、RNA功能网络、RNA与蛋白质互作、RNA修饰及RNA二级结构的信息解析技术。

关键词：测序技术非编码RNA 靶标鉴定 RNA-蛋白质互作 RNA修饰二级结构

药物亲和反应的靶点稳定性技术及其应用研究进展

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中国药理学与毒理学杂志 2016年第11期30卷 1225-1229页

作者：徐朝顾伟桢邓建平许启泰许君河南农业大学生命科学学院河南郑州450002 海南绿槟榔科技发展有限公司海南万宁571500

药物靶标是指存在于组织细胞内与药物相互作用,并赋予药物效应的特定分子,>98%药物靶标为蛋白质。药物与细胞内靶标相互作用,是药物发挥作用的基础。如何综合运用多种研究方法发现和确证药物作用新靶标是目前研究者面临的重要挑战。药... 详细信息

药物靶标是指存在于组织细胞内与药物相互作用,并赋予药物效应的特定分子,>98%药物靶标为蛋白质。药物与细胞内靶标相互作用,是药物发挥作用的基础。如何综合运用多种研究方法发现和确证药物作用新靶标是目前研究者面临的重要挑战。药物亲和反应的靶点稳定性(DARTS)技术是根据小分子药物与其靶标蛋白结合后导致对蛋白酶敏感性下降而发展起来的一项新技术,由于无需药物保护性修饰且无药物活性依赖性,因此可广泛应用于药物筛选与靶标鉴定。本文对DARTS技术的发现、技术原理及方法要点和应用进行综述。

关键词：药物亲和反应的靶点稳定性药物筛选靶标鉴定蛋白酶

中药单体小檗碱靶向降解CML特征性蛋白BCR-ABL及其机制的研究

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中国病理生理杂志 2019年第10期35卷 1804-1809页

作者：费雲昊阴钊丰茂晓刘燕君费嘉暨南大学基础医学院生物化学与分子生物学系

目的:探讨中药单体小檗碱在慢性粒细胞白血病(CML)中的靶标及其降解CML特征性蛋白BCR-ABL的机制。方法:实验分为小檗碱处理组和非处理组,通过分子模拟对接的方法预测小檗碱在CML中的直接靶标是否为其特征性蛋白BCR-ABL;通过表面等离子... 详细信息

目的:探讨中药单体小檗碱在慢性粒细胞白血病(CML)中的靶标及其降解CML特征性蛋白BCR-ABL的机制。方法:实验分为小檗碱处理组和非处理组,通过分子模拟对接的方法预测小檗碱在CML中的直接靶标是否为其特征性蛋白BCR-ABL;通过表面等离子体共振成像(SPRi)的方法验证小檗碱与ABL1蛋白的结合。Western blot验证小檗碱作用后BCR-ABL表达量的变化,以及CML细胞内泛素化蛋白酶体途径和BCR-ABL蛋白泛素化的变化。结果:分子模拟对接结果表明,小檗碱可以和ABL1蛋白结合;SPRi实验结果显示小檗碱可以直接和ABL1蛋白的SH3-SH2、PTK及F-actin结构域结合。根据前期实验结果,我们选取5μmol/L小檗碱处理CML细胞4、12和24 h后,Western blot结果显示小檗碱可以时间依赖性地降解CML特征性蛋白BCR-ABL(P<0.05)。小檗碱处理CML细胞后,Western blot结果显示小檗碱可以显著促进细胞的泛素化水平;针对BCR-ABL的免疫沉淀结果显示,小檗碱作用后细胞中BCR-ABL蛋白的泛素化水平显著增强。结论:小檗碱直接靶向CML特征性蛋白BCR-ABL,并且通过增强泛素化蛋白酶体途径来降解BCR-ABL蛋白。

关键词：小檗碱 BCR-ABL融合蛋白靶标鉴定泛素化慢性粒细胞白血病

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靶向“不可成药”蛋白:中药的优势和机遇

上海中医药杂志 2022年第5期56卷 14-18,13页

作者：朱慧敏汪磊慎梦真柯细松屈祎上海中医药大学交叉科学研究院上海201203 上海市中药化学生物学前沿基地上海201203

靶向治疗是肿瘤治疗领域过去30年来的重要突破之一,但创新药物发现已经出现了挑战,即在世界范围内都出现靶点扎堆或耗尽的现象。另一方面,肿瘤生物学家已经鉴定了多达数百种肿瘤治疗靶标,其中90%以上属于所谓的“无药可靶”或“不可成... 详细信息

靶向治疗是肿瘤治疗领域过去30年来的重要突破之一,但创新药物发现已经出现了挑战,即在世界范围内都出现靶点扎堆或耗尽的现象。另一方面,肿瘤生物学家已经鉴定了多达数百种肿瘤治疗靶标,其中90%以上属于所谓的“无药可靶”或“不可成药”蛋白。针对这种靶点扎堆和“无药可靶”并存的困境,课题组提出“表型发现-靶标鉴定-表型验证”的靶向药物发现新策略,理论上适用于任意目标蛋白。基于这种策略,我国传统中药由于其生物活性好、来源丰富以及有中医临床应用经验等优点,在基于表型的创新药物发现中具有独特的优势,是发现“无药可靶”或“不可成药”蛋白靶向小分子的重要源泉。与之对应的是,广泛的中药靶标鉴定有望在分子水平阐明中药的作用机制,是中药现代化研究的机遇。

关键词：中药靶向治疗表型靶标鉴定创新药物发现“ 不可成药”蛋白

基于CRISPR-Cas12b的空肠弯曲菌检测系统的建立及初步应用

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基于CRISPR-Cas12b的空肠弯曲菌检测系统的建立及初步应用

作者：黄钰扬州大学

学位级别：硕士

由病原微生物引起的生物安全问题一直是社会关注的热点,空肠弯曲菌作为可引起人细菌性肠炎和格林-巴利综合症等疾病的一类重要人畜共患病原菌,对食品安全和公共卫生安全造成着极大的威胁。因此,空肠弯曲菌检测已成为公共卫生、食品安全... 详细信息

由病原微生物引起的生物安全问题一直是社会关注的热点,空肠弯曲菌作为可引起人细菌性肠炎和格林-巴利综合症等疾病的一类重要人畜共患病原菌,对食品安全和公共卫生安全造成着极大的威胁。因此,空肠弯曲菌检测已成为公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中的必检项目。但是传统的空肠弯曲菌检测方法存在操作复杂、检测周期长等缺点,难以满足现场快速检测的要求,因此亟需开发新的检测方法以满足现场检测的需要。基于CRISPR-Cas的核酸检测方法具有快速、精准检测病原微生物的应用潜力,但鉴定目标病原微生物特异且保守的靶标序列是限制该方法应用的瓶颈。在此背景下,本研究开发了鉴定目标病原微生物特异、保守靶标序列的生物信息学分析流程,并依此建立了基于CRISPR-Cas12b的空肠弯曲菌检测系统,以实现对空肠弯曲菌的快速、精准的现场检测。本研究首先在NCBI Refseq数据库中下载了 2495个可获得的弯曲菌基因组序列,在去除高片段化（scaffolds＞100）及与空肠弯曲菌标准菌株NCTC11351T基因组核苷酸相似性低于定种阈值（ANI＜95%）的基因组后,共获得1037株高质量的空肠弯曲菌基因组序列;进而基于同一策略筛选出600株高质量的结肠弯曲菌基因组序列。最后,使用Neptune软件对代表性的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌群体基因组进行比较分析,共获得15个空肠弯曲菌特异且保守的靶标序列（score＞0.95）。进一步从中挑选代表性序列设计CRISPR-Cas12b检测系统构建所需的长度为20 bp的protospacer序列,并最终获得一组高质量的protospacer序列,该序列在98.75%（1024/1037）的空肠弯曲菌基因组中完全一致,且在其他物种的基因组中都未检测到该序列。扩增获得了 Cas12b基因的全长序列,进而构建了 Cas12b-pET-28a重组表达质粒并导入大肠杆菌BL21（DE3）中。经Cas12b蛋白的诱导表达纯化等试验,获得了可用于构建检测系统的Cas12b蛋白;进一步基于上述分析所获的protospacer序列,设计并制备了适用于Cas12b的sgRNA,最终组装形成了基于CRISPR-Cas12b的空肠弯曲菌检测系统。基于单种病原菌DNA和多种病原菌的混合DNA对检测系统的特异性进行了评估,结果表明仅在空肠弯曲菌DNA存在时检测系统才会产生强烈的荧光信号,说明该检测系统有很高的特异性。基于DNA梯度稀释的试验结果表明,该检测系统的最低检测限为204 ag/μL,灵敏度达到亚渺摩尔级。进一步基于实验室条件下的空肠弯曲菌模拟污染实验对该检测系统的可靠性进行了评估。结果显示,该系统的最低检测限可达到10 CFU/g鸡肉样品,比传统的基于弯曲菌分离培养的检测技术的灵敏度高10倍以上。使用该检测系统对采集自本地菜市场活禽屠宰区域的鸡肉和环境样品进行检测,结果同样证实该检测系统的灵敏度（82.2%）高于基于弯曲菌分离培养的方法（68.6%）。本检测系统从样品收集到获得结果的时间约为40分钟,显示出其具有现场快速、精准检测空肠弯曲菌的应用潜力。本研究建立了基于生物信息学指导的病原微生物特异靶标序列鉴定的流程,并首次建立了基于CRISPR-Cas12b的空肠弯曲菌快速、精准的检测系统,该检测系统在食品安全、公共卫生安全中具有较高的应用价值。

关键词：病原微生物空肠弯曲菌 CRISPR-Cas12b 靶标鉴定检测技术

第一部分基于化学蛋白质组学方法研究尼达尼布分子作用的新机制第二部分 IMM-H007的多晶型研究及药动学评价

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第一部分基于化学蛋白质组学方法研究尼达尼布分子作用的新机制 ...

作者：陈雄北京协和医学院

学位级别：硕士

尼达尼布是一种血小板源性生长因子受体（Platelet-derived growth factor receptors,PDGFR）、血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptors,VEGFR）、成纤维细胞生长因子受体（Fibroblast growth factor receptors,FGFR）三联血管激酶抑制剂。到目前为止,FDA批准了三个适应症:特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）、慢性纤维化性间质性肺病（Chronic fibrosing interstitial lung disease,ILDs）及系统性硬化相关间质性肺病（Systemic sclerosis-associated interstitial lung disease,SSc-ILD）。由于 IPF 发病机制不明,且其它 PDGFR、VEGFR、FGFR抑制剂都不具有抗IPF的作用,尼达尼布抗IPF的直接作用靶标仍不明确。本课题在尼达尼布构效关系基础上,设计、合成了 5个探针分子:P1-P5。通过生物活性评价获得了活性保留的光亲和探针P2,P3,利用胶内荧光成像实验确证了探针的光标记能力,并且对探针的浓度、孵育时间进行了优化。竞争性结合实验表明探针与尼达尼布结合相同的分子靶标。利用基于亲和性的蛋白质分析技术（Affinity-based protein profiling,AfBPP）,我们采用探针P3在人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）内进行了靶标垂钓,并利用生物质谱进行靶标鉴定。通过分析质谱数据,我们首次鉴定到三肽基肽酶1（Tripeptidyl-peptidase 1,TPP1）是尼达尼布的潜在直接作用靶标。Western blot验证结果表明TPP1与尼达尼布存在直接相互作用,共聚焦荧光显微镜实验表明探针与TPP1存在共定位,分子对接结果显示尼达尼布可以占据TPP1招募端粒酶的活性口袋TPP1-OB结构域,并与其中的关键氨基酸残基形成相互作用。端粒酶调控与细胞增殖、IPF发生密切相关,尼达尼布可能通过结合TPP1,影响端粒酶招募,进而介导其抗IPF作用。此外,采用相同的技术策略与分析流程,我们利用探针P2在人肺成纤维细胞（HPF）内进行了尼达尼布结合蛋白的鉴定。结果表明,盘状结构域受体 2（Discoidindomain-containingreceptor2,DDR2）与 TANK 结合激酶1（TANK-binding kinase 1,TBK1）是尼达尼布的高置信度潜在分子靶标,两者富集程度在竞争组下调最为明显,且均与细胞增殖、IPF表型高度相关,值得进行深入研究。本课题利用AfBPP技术首次发现血管激酶之外的尼达尼布新靶标TPP1及潜在靶标DDR2、TBK1。这些新发现的分子靶标增加了我们对尼达尼布作用机制的理解,为IPF、ILDs、SSc-ILD等疾病的治疗提供了新的启示。药物分子多存在多晶型现象,是影响药品质量与疗效的重要因素。2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N6-（3-羟基苯基）腺苷（IMM-H007）由天然产物虫草素改造而来,临床研究显示其降血脂作用良好。本文对IMM-H007的多晶型现象进行了研究,首先通过晶型筛选,发现其存在两种晶型状态,并通过适当的方法制备得到了H、L两种晶型。采用多种技术手段对晶型进行表征,热重分析结果显示两种晶型均为非溶剂晶型,粉末X射线衍射法、差示扫描量热法、红外光谱法均可实现不同晶型的鉴别。通过培养单晶,我们确定了 IMM-H007的绝对构型及H晶型的晶体参数。在加速试验条件下,两种晶型均具有良好的稳定性。药代动力学研究显示,两种晶型的生物利用度存在较大差异,H晶型显著优于L晶型。

关键词：尼达尼布作用机制基于亲和性的蛋白质分析技术靶标鉴定降血脂晶型表征药代动力学

有机合成及应用研究：立体选择性构建吲哚酮螺环及抗细胞迁移分子探针的实现

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有机合成及应用研究：立体选择性构建吲哚酮螺环及抗细胞迁移分子...

作者：邵辉武汉科技大学

学位级别：硕士

本文研究了3-(3’-吡咯烷)吲哚酮螺环的立体选择性合成方法,并通过两种分子探针的合成及其生物活性研究初步标记细胞迁移作用细胞位点与靶标蛋白,这两项基于有机合成及其应用的研究对抗肿瘤药物的设计、制备及药理研究有着重要指导意义... 详细信息

本文研究了3-(3’-吡咯烷)吲哚酮螺环的立体选择性合成方法,并通过两种分子探针的合成及其生物活性研究初步标记细胞迁移作用细胞位点与靶标蛋白,这两项基于有机合成及其应用的研究对抗肿瘤药物的设计、制备及药理研究有着重要指导意义。在在3-(3’-吡咯烷)吲哚酮螺环的立体选择性合成方面,本文研究了曼尼希反应所构建螺环产物的立体构型受金属催化剂种类、手性胺配体、溶剂、温度等因素的影响规律。研究结果表明以2-氧-L-色氨酸甲酯盐酸盐和苯甲醛为底物,ZnCl-2,2’-二氨基联苯复合物为催化体系,KCO为碱,1,4-二氧六环和水(v:v=9:1)混合溶剂,底物的摩尔比为1:3,反应温度为50℃,以占91%的选择性得到(3R,2’S)构型3-(3’-吡咯烷)吲哚酮螺环化合物,这些结果为进一步研究3-(3’-吡咯烷)吲哚酮螺环的高选择性合成指明了方向。在细胞迁移抑制剂的分子探针研究方面,本文设计与合成了以荧光素或生物素为报告基团、赖氨酸为链接基团、拟肽细胞迁移抑制剂为识别基团的分子探针,质谱分析表明所合成两种分子探针的结构正确,细胞共孵育实验表明此类分子探针能有效标记出迁移抑制剂在肿瘤细胞上的受体蛋白,细胞裂解液共孵育及电泳实验表明分子探针所结合的靶标蛋白分子量约为250 kDa,本文所合成的分子探针为确定细胞迁移抑制剂的靶标及作用机制研究提供了有效物质手段。

关键词： 3-(3’-吡咯烷)吲哚酮螺环立体选择性合成分子探针细胞迁移抑制靶标鉴定

基于活性和基于亲和性的蛋白质表达谱在药理毒理学研究中的应用进展

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中国药理学与毒理学杂志 2023年第12期37卷 951-958页

作者：陈佳胜张鑫月刘俊宏孟文琪张玲徐州医科大学药学院江苏徐州221004 海军军医大学海军医学系上海200433

基于活性的蛋白质表达谱(ABPP)和基于亲和性的蛋白质表达谱(AfBPP)分析技术是以化合物为中心的化学蛋白质组学技术,在鉴定小分子药物和(或)毒物的直接作用靶点方面具有显著优势。明确直接作用靶点有助于更加全面地认识小分子化合物的药... 详细信息

基于活性的蛋白质表达谱(ABPP)和基于亲和性的蛋白质表达谱(AfBPP)分析技术是以化合物为中心的化学蛋白质组学技术,在鉴定小分子药物和(或)毒物的直接作用靶点方面具有显著优势。明确直接作用靶点有助于更加全面地认识小分子化合物的药理毒理机制。本文简要介绍ABPP和AfBPP技术,并总结了近年来该技术在药物脱靶、毒物靶点鉴定方面的应用实例,如克雷诺拉尼、BIA 10-2474和奥利司他等药物的脱靶效应及VX、杀螟硫磷和丙烯醛等有毒化合物的直接作用靶点鉴定,以期对药理学、毒理学和化学生物学研究有一定的启发和借鉴意义。

关键词：基于活性的蛋白质表达谱基于亲和性的蛋白质表达谱靶标鉴定药物脱靶效应毒性化合物

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华蟾毒精抗肿瘤分子靶标研究

华蟾毒精抗肿瘤分子靶标研究

作者：汪磊上海中医药大学

学位级别：硕士

【目的】华蟾毒精是临床常用传统中药蟾酥的主要有效成分之一,但是目前华蟾毒精的抗肿瘤分子靶标仍不明确。本研究利用Drug Target Seq策略来发现华蟾毒精在结肠癌细胞中的分子靶标,并通过多种鉴定方法和功能实验进行靶标验证。【方法... 详细信息

【目的】华蟾毒精是临床常用传统中药蟾酥的主要有效成分之一,但是目前华蟾毒精的抗肿瘤分子靶标仍不明确。本研究利用Drug Target Seq策略来发现华蟾毒精在结肠癌细胞中的分子靶标,并通过多种鉴定方法和功能实验进行靶标验证。【方法】利用CCK-8实验检测蟾酥各活性成分毒性大小;根据Drug Target Seq靶标鉴定策略,建立结肠癌单细胞系HCT116X,并通过2-4周持续性加药处理HCT116X建立华蟾毒精耐药细胞;通过耐药程度测定和多药耐药排除筛选出华蟾毒精特异性耐药细胞;制备RNA样品并进行RNA-Seq;通过对RNA-Seq数据进行基因组比对、差异突变基因分析和突变频率分析获得耐药细胞的突变基因,即华蟾毒精的潜在靶标编码基因;利用靶标鉴定实验DARTS和CETSA验证华蟾毒精和潜在靶标的结合;通过差异表达基因分析和功能注释GO富集分析和KEGG Pathway分析发现华蟾毒精影响的功能和信号通路;通过免疫荧光实验观察华蟾毒精对微管结构的影响。【结果】华蟾毒精是蟾酥各活性成分中毒性最强的成分;本研究成功构建结肠癌细胞HCT116的单细胞系HCT116X,并测定了华蟾毒精对其的IC50为0.15μM;成功建立31个华蟾毒精耐药细胞;经过耐药性检测和多药耐药排除有13个华蟾毒精特异性耐药细胞;RNA-Seq数据表明平均每个样品测得16356个突变;差异突变基因分析得到194个差异突变基因;基因突变频率分析表明包括TRAK2、KATNB1在内的6个基因是突变频率最高的基因。DARTS和CETSA实验均表明华蟾毒精和TRAK2蛋白没有直接结合能力,而与KATNB1蛋白有直接结合能力;CETSA实验表明华蟾毒精和KATNB1（Val299Met）不直接结合。GO分析表明华蟾毒精处理使差异表达基因显著富集在纺锤体,中心体等结构和泛素以及降解等生物功能上。KEGG Pathway分析表明差异表达基因显著富集在核糖体等结构和代谢、衰老、降解等功能。免疫荧光实验显示华蟾毒精具有微管解聚作用。【结论】本研究利用Drug Target Seq策略发现了华蟾毒精在结肠癌细胞中的潜在分子靶标TRAK2和KATNB1,并证实了KATNB1蛋白与华蟾毒精在结肠癌细胞中的直接结合,最后在基因表达水平和细胞水平发现华蟾毒精对KATNB1的功能靶向调控作用。

关键词：华蟾毒精 KATNB1 靶标鉴定蟾酥转录组测序