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生物活性小分子的靶标鉴定

中国新药杂志 2015年第10期24卷 1119-1123页

作者：王冬尧陈啸飞曹岩朱臻宇张俊平柴逸峰中国人民解放军第二军医大学药学院上海200433

生物活性小分子靶标的明确鉴定需要整合多种分析方法,从多层次、多角度阐明其作用靶标的有效性和专属性。即使这样也都无法排除假阳性或者假阴性的产生,只有各种方法联用才能有力阐明小分子的生物活性与相应靶标。本文系统综述了生物活... 详细信息

生物活性小分子靶标的明确鉴定需要整合多种分析方法,从多层次、多角度阐明其作用靶标的有效性和专属性。即使这样也都无法排除假阳性或者假阴性的产生,只有各种方法联用才能有力阐明小分子的生物活性与相应靶标。本文系统综述了生物活性小分子靶标鉴定与验证的方法,总结为直接法(包括生物素亲和标签、亲和胶、噬菌体展示、光交联法、亲和磁珠法等)和间接法(包括药物亲和反应靶标分析、蛋白质组学分析、化学基因组学分析和代谢组学分析等)两种。每种方法分别列举了1个实例,并讨论了其优势和劣势,以明确其适用范围和应用前景。

关键词：生物活性小分子靶标鉴定直接法间接法整合

靶向人胶质瘤细胞的核酸适配体用于体内成像及其靶标鉴定的研究

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靶向人胶质瘤细胞的核酸适配体用于体内成像及其靶标鉴定的研究

作者：林宁钦福建医科大学

学位级别：硕士

目的:脑胶质瘤的影像学诊断主要依靠计算机断层扫描和核磁共振成像,而一些非肿瘤性疾病容易与其混淆,造成误诊。分子影像学技术可以通过靶向识别分子探针,实现细胞或分子水平的生物学成像,为解决影像学的误诊问题提供了有力的工具。作... 详细信息

目的:脑胶质瘤的影像学诊断主要依靠计算机断层扫描和核磁共振成像,而一些非肿瘤性疾病容易与其混淆,造成误诊。分子影像学技术可以通过靶向识别分子探针,实现细胞或分子水平的生物学成像,为解决影像学的误诊问题提供了有力的工具。作为一种新型靶向识别分子,核酸适配体具有亲和力强、生物相容性好等优点,广泛应用于肿瘤细胞的体内外成像。本研究旨在通过化学修饰来改进靶向脑胶质瘤细胞的核酸适配体,评估修饰后核酸适配体的靶向识别能力和体内稳定性;并通过荷瘤小鼠模型测试,明确核酸适配体用于脑胶质瘤活体成像的可行性;最后通过联用质谱分析等技术,鉴定核酸适配体的靶标分子。本研究将以靶向脑胶质瘤细胞的核酸适配体为基点,为基于核酸适配体的脑胶质瘤活体分子成像奠定基础,并有望进一步为脑胶质瘤的诊断提供新的候选靶点。方法:1、对核酸适配体进行化学修饰,采用流式细胞术检测修饰后核酸适配体与胶质瘤细胞的结合效果,采用琼脂糖凝胶电泳检测修饰后核酸适配体在血清中的稳定性,评估核酸适配体分子探针的靶向识别能力和体内稳定性;2、通过异种移植方式构建脑胶质瘤荷瘤小鼠模型,以荧光修饰的核酸适配体作为分子探针,采用小动物活体成像技术对核酸适配体分子探针和随机序列的体内分布情况进行监测,探究核酸适配体分子探针用于脑胶质瘤活体成像的可行性;3、采用核酸适配体分离富集、质谱分析等手段鉴定核酸适配体的靶标分子,并采用蛋白质印迹法（Western blot）、表面等离子共振技术（SPR）、小干扰RNA转染等方法验证核酸适配体的靶标;4、采用免疫组织化学染色法,检测10例正常脑组织,44例星形细胞瘤（WHO II-III）,22例胶质母细胞瘤（WHO IV）中靶标分子的表达情况。结果:1、化学修饰后核酸适配体分子依然具有靶向识别胶质瘤细胞的能力,且修饰后,核酸适配体在血清中的稳定存在时间可以长达24小时,比未进行化学修饰的核酸适配体提高了12小时,说明化学修饰后的核酸适配体分子探针保留了靶向识别能力,并具有良好的血清稳定性;2、荷瘤小鼠活体荧光成像结果显示核酸适配体可以特异性的富集在小鼠的肿瘤部位,注射1小时后肿瘤部位荧光信号达到最强,注射4小时后肿瘤部位仍可以观察到明显信号,初步实现基于核酸适配体分子探针的脑胶质瘤小鼠活体成像,表明核酸适配体分子探针具有用于脑胶质瘤活体成像的可行性;3、聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示在260 kDa附近,核酸适配体组的泳道有一明显差异条带,质谱结果显示核酸适配体的靶标分子可能是纤维粘连蛋白,Western blot结果显示只有在核酸适配体组检测到纤维粘连蛋白的存在,SPR结果显示核酸适配体与纤维粘连蛋白的平衡解离常数是125nM,小干扰RNA转染结果显示敲低纤维粘连蛋白后的胶质瘤细胞与核酸适配体的结合效果减弱,多方面验证结果均显示核酸适配体的靶标分子为纤维粘连蛋白;4、免疫组织化学染色结果显示纤维粘连蛋白在正常脑组织、星形细胞瘤（WHO II-III）和胶质母细胞瘤（WHO IV）的组织化学评分的均值分别为5.62,56.99,95.93,该蛋白的表达水平随着脑胶质瘤恶性程度的升高而增加。结论:1、化学修饰后的核酸适配体分子探针具有良好的血清稳定性,并保留原有的靶向识别能力;2、初步实现基于核酸适配体分子探针的脑胶质瘤小鼠活体成像,表明核酸适配体分子探针具有用于脑胶质瘤活体成像的潜力;3、核酸适配体结合胶质瘤细胞的靶标分子是纤维粘连蛋白,该蛋白的表达水平随着脑胶质瘤恶性程度的升高而增加。

关键词：脑胶质瘤核酸适配体活体分子探针成像靶标鉴定纤维粘连蛋白

小麦条锈菌吸器效应蛋白筛选及效应蛋白靶标鉴定

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小麦条锈菌吸器效应蛋白筛选及效应蛋白靶标鉴定

作者：王婷西北农林科技大学

学位级别：硕士

条形柄锈菌（Puccinia striiformis f.***.tritici,Pst）引起的小麦条锈病（wheat stripe rust or yellow rust）是小麦上的重大病害,培育抗病品种是防治小麦条锈病最经济、有效、安全的措施。然而因为小麦条锈菌毒性变异快,病原菌的致... 详细信息

条形柄锈菌（Puccinia striiformis f.***.tritici,Pst）引起的小麦条锈病（wheat stripe rust or yellow rust）是小麦上的重大病害,培育抗病品种是防治小麦条锈病最经济、有效、安全的措施。然而因为小麦条锈菌毒性变异快,病原菌的致病机理及与寄主的互作机制不明确,加之缺乏有效的遗传转化体系,导致病害的持久防控难以实现。作为活体营养型病原菌,小麦条锈菌能够产生特殊的侵染结构,通过吸器吸收寄主细胞的营养供给自身的生长发育。细胞学研究表明吸器能够分泌效应蛋白,转运进入寄主细胞,从而发挥毒性或无毒性的双重功能。但是效应蛋白是如何发挥功能及其作用机制是什么还尚不明确。因而,本论文围绕上述问题开展以下三方面的研究:首先在吸器转录组测序的基础上,对吸器特异表达的效应蛋白进行系统性筛选;其次对较为关键的效应蛋白进行互作靶标的鉴定;最后通过对两个候选无毒蛋白Ps5578和Ps4941的互作靶标进行筛选,以期获得潜在的抗病基因,为条锈菌致病机理及寄主防御机制的研究奠定基础。主要研究结果如下:（1）在吸器转录组测序的基础上,通过生物信息学分析,获得355个分泌蛋白。选择其中65个候选分泌蛋白利用烟草瞬时表达系统和细菌III型分泌系统进行筛选,获得了6个能够抑制BAX诱导的PCD和寄主小麦防御反应（PTI、ETI）的小麦条锈菌吸器效应蛋白。但瞬时表达效应蛋白对条锈菌的生长发育没有显著影响。（2）选取条锈菌与小麦互作过程中能够抑制寄主PTI和ETI且在吸器特异诱导表达量高的效应蛋白进行互作靶标的筛选与鉴定工作。利用酵母双杂交技术筛选获得了Hasp68的寄主靶标,为小麦的组织蛋白酶B（TaCB）,并通过BiFC验证了它们互作的真实性。研究报道,TaCB与植物的PCD相关,因此推测效应蛋白Hasp68可能通过调控寄主植物的PCD过程发挥毒性作用。（3）在前期获得了条锈菌候选无毒性效应蛋白Ps5578和Ps4941的基础上,利用酵母双杂交技术筛选获得了两个效应蛋白的共同寄主靶标,即电子传递链中间体—小麦细胞色素b6-f复合物铁硫亚基（TaISP）。此外,还获得了Ps5578的另一个寄主靶标:半胱氨酸蛋白酶（TaCP）,并通过Bi FC技术进一步验证了上述互作的真实性。同时,研究还发现Ps5578与Ps4941和靶标蛋白互作超过72 h之后,植物细胞出现大面积的坏死。DAB染色烟草叶片发现,单独注射靶标或无毒性效应蛋白与靶标共同注射均有ROS积累,进一步证明了Ps5578和Ps4941的无毒性功能,表明它们通过与寄主靶标的互作引发寄主的防卫反应。

关键词：小麦条锈菌吸器效应蛋白筛选靶标鉴定

苹果树腐烂病菌外泌蛋白Vmhp-1互作靶标的鉴定及其干扰免疫功能的研究

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苹果树腐烂病菌外泌蛋白Vmhp-1互作靶标的鉴定及其干扰免疫功能的...

中国植物病理学会2019年学术年会

作者：高晨许铭刘召阳高宇琪黄丽丽冯浩旱区作物逆境生物学国家重点实验室西北农林科技大学植物保护学院

苹果树腐烂病是由黑腐皮壳属真菌Valsa mali引起的枝干病害。解析病菌与寄主的互作机理对病害防控新策略的研发具有重要意义。笔者实验室前期研究发现苹果树腐烂病菌Vmhp-1在侵染过程中上调表达,并通过酵母异源表达后证明Vmhp-1是一种... 详细信息

苹果树腐烂病是由黑腐皮壳属真菌Valsa mali引起的枝干病害。解析病菌与寄主的互作机理对病害防控新策略的研发具有重要意义。笔者实验室前期研究发现苹果树腐烂病菌Vmhp-1在侵染过程中上调表达,并通过酵母异源表达后证明Vmhp-1是一种外泌蛋白,更重要的是缺失后突变体致病力较野生型显著降低。在此基础上,本研究利用非寄主本氏烟瞬时表达系统发现Vmhp-1会抑制由Bax引起的细胞坏死。亚细胞定位分析发现Vmhp-1定位在烟草细胞膜上,而去掉信号肽Vmhp-1定位在细胞膜和细胞核。Vmhp-1瞬时表达后,水杨酸(SA)通路(NbPR1和NbPR2)、茉莉酸(JA)通路(NbPR4和NbLOX)和乙烯(ETH)通路(ERF1)上的5个maker基因均下调表达,且Vmhp-1可以抑制INF1诱导的活性氧迸发和胼胝质的沉积。同时研究发现,Vmhp-1瞬时表达后降低了烟草对核盘菌(S.sclerotiorum)的抗性水平。进而利用酵母双杂交系统(YH)、双分子荧光(Bifc)和免疫共沉淀技术(Co IP)鉴定到2个与Vmhp-1互作的候选植物靶标。本研究结果为揭示外泌蛋白Vmhp-1调控寄主免疫反应的分子机理奠定了重要基础。

关键词：苹果树腐烂病菌外泌蛋白靶标鉴定植物免疫

来源： cnki会议评论

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化学小分子靶标鉴定方法的研究进展

医学综述 2020年第7期26卷 1293-1297,1303页

作者：陈杰波蔡军上海交通大学医学院上海200025 上海交通大学医学院病理学系上海200025

具有生物活性的化学小分子常通过与一个或多个细胞蛋白结合以调控细胞或组织的多种生物学效应,其靶标的鉴定成为完全了解药物作用机制的关键,也成为药物研发的重点内容。近年来在化学小分子靶标蛋白鉴定方面不断涌现出新技术和新方法,... 详细信息

具有生物活性的化学小分子常通过与一个或多个细胞蛋白结合以调控细胞或组织的多种生物学效应,其靶标的鉴定成为完全了解药物作用机制的关键,也成为药物研发的重点内容。近年来在化学小分子靶标蛋白鉴定方面不断涌现出新技术和新方法,目前的鉴定方法是基于基因组学、蛋白质组学、克隆扩增、数据库比较分析、基于副作用报告系统的统计计算5个方面有效筛选并鉴定小分子化合物的靶标,各种方法均存在优势,但也存在局限性。随着研究的深入,更加完善的方法也将出现。

关键词：化学小分子靶标鉴定药物研发基因组学蛋白质组学

肿瘤Wnt/β-catenin信号通路抑制剂的发现及其靶标鉴定

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肿瘤Wnt/β-catenin信号通路抑制剂的发现及其靶标鉴定

第十届全国化学生物学学术会议

作者：屈祎张卫东柯细松上海中医药大学中药化学生物学研究中心

大规模的基因组测序在多种主要类型肿瘤尤其是结肠癌组织中发现Wnt/β-catenin信号通路的高频率激活性突变,然而,迄今为止临床上尚无靶向Wnt/β-catenin信号通路的治疗药物。在过去的几年中,我们通过筛选美国FDA批准的药物库,发现了数... 详细信息

大规模的基因组测序在多种主要类型肿瘤尤其是结肠癌组织中发现Wnt/β-catenin信号通路的高频率激活性突变,然而,迄今为止临床上尚无靶向Wnt/β-catenin信号通路的治疗药物。在过去的几年中,我们通过筛选美国FDA批准的药物库,发现了数个新型Wnt/β-catenin信号通路抑制剂,并在APC突变的结肠癌细胞、肠道类器官、转基因斑马鱼和Apc突变小鼠中证实了药物对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。值得注意的是,在Wnt/β-catenin信号通路激活肿瘤细胞中,这些小分子显著性地诱导癌细胞的Wnt信号不对称分裂和DNA在细胞分裂过程中的不对称分离。通过联用DARTS技术和双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）和蛋白质谱（MS）技术,我们鉴定了这些临床药物以前未知的直接结合蛋白,鉴定了介导药物抑制Wnt/β-catenin信号通路的靶标蛋白,并发现了一种新的β-catenin蛋白修饰模式-瓜氨酸化。我们的结果为抗癌药物发现和基于靶标蛋白鉴定的药物作用机制研究提供了一个新策略。

关键词： Wnt/β-catenin信号通路药物发现靶标鉴定

来源： cnki会议评论

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miRNA体内作用靶标鉴定的策略

中国生物工程杂志 2009年第3期29卷 85-88页

作者：汪军玲王松太武汉大学药学院武汉430072 武汉生物工程学院生物工程系武汉430415

miRNAs是一类重要的基因表达调节因子,近年的研究表明miRNA在控制细胞的生长发育、分化、凋亡等过程中发挥着十分重要的作用。但对miRNA作用机制和分子功能的研究却进展缓慢,归其原因是miRNA和靶标之间非完全配对,缺乏快捷有效的靶标鉴... 详细信息

miRNAs是一类重要的基因表达调节因子,近年的研究表明miRNA在控制细胞的生长发育、分化、凋亡等过程中发挥着十分重要的作用。但对miRNA作用机制和分子功能的研究却进展缓慢,归其原因是miRNA和靶标之间非完全配对,缺乏快捷有效的靶标鉴定方法。因此,就miRNA靶标鉴定的策略作一综述。miRNA调节靶标的鉴定有助于揭示一些疾病的致病机理,发现可用于治疗的新分子靶标,为基因治疗奠定基础。

关键词： miRNA 靶标鉴定分子靶标

化学蛋白质组学鉴定天然产物作用靶标的研究进展

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天然产物研究与开发 2020年第1期32卷 144-152页

作者：王平罗佳李海舟许敏昆明理工大学生命科学与技术学院

活性天然产物的作用靶标、具体作用机制难以确定,阻碍了其在新药研发方面的发展。化学蛋白质组学,特别是基于亲和性蛋白组学分析方法(affinity-based protein profiling,ABPP),经过近年的发展,已成为较为成熟的鉴定天然产物作用靶标的... 详细信息

活性天然产物的作用靶标、具体作用机制难以确定,阻碍了其在新药研发方面的发展。化学蛋白质组学,特别是基于亲和性蛋白组学分析方法(affinity-based protein profiling,ABPP),经过近年的发展,已成为较为成熟的鉴定天然产物作用靶标的方法。本文主要以天然产物结构进行分类介绍了基于亲和性蛋白组学分析方法(affinity-based protein profiling,ABPP)在天然产物作用靶标鉴定方面的应用,并讨论了各种探针设计的应用范围以及优缺点,且对ABPP方法的发展应用和其他靶标蛋白鉴定方法进行展望。

关键词：天然产物化学蛋白质组学 ABPP 靶标鉴定

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miRNA体内作用靶标鉴定的策略

武汉生物工程学院学报 2008年第4期 230-234页

作者：汪军玲王松太邓家庆武汉生物工程学院生物工程系武汉生物工程学院生物技术系

阐述了miRNA对其靶标的调控作用,介绍了近年来miRNA靶标鉴定的研究方法和策略,以期为miRNA作用机制和分子功能的研究提供一些思路和启发。深入理解miRNA的调节靶标有助于揭示一些疾病的致病机理和发现可用于治疗的新分子靶标,为基因治... 详细信息

阐述了miRNA对其靶标的调控作用,介绍了近年来miRNA靶标鉴定的研究方法和策略,以期为miRNA作用机制和分子功能的研究提供一些思路和启发。深入理解miRNA的调节靶标有助于揭示一些疾病的致病机理和发现可用于治疗的新分子靶标,为基因治疗奠定基础。

关键词： miRNA 靶标鉴定分子靶标