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靶向CUGBP1改善肝纤维化及其机制的研究

靶向CUGBP1改善肝纤维化及其机制的研究

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作者：邵粉丽南京大学

学位级别：硕士

肝纤维化是由多种慢性肝疾病引发肝脏中肝细胞坏死、肌成纤维细胞活化导致的肝脏疾病,主要特点是细胞外基质沉积。肝组织中细胞外基质沉积阻碍肝细胞与血液间的物质交换,导致肝功能失调。长期肝纤维化会发展成肝硬化,肝硬化是一种具有... 详细信息

肝纤维化是由多种慢性肝疾病引发肝脏中肝细胞坏死、肌成纤维细胞活化导致的肝脏疾病,主要特点是细胞外基质沉积。肝组织中细胞外基质沉积阻碍肝细胞与血液间的物质交换,导致肝功能失调。长期肝纤维化会发展成肝硬化,肝硬化是一种具有高发病率和高死亡率的疾病。肝星状细胞活化在肝纤维化过程中起重要作用,所以靶向肝星状细胞已经成为治疗肝纤维化新的策略。在第一章我们详细描述了肝纤维化的分子机制和过程以及肝星状细胞活化在肝纤维化过程中的作用,另外总结了 RNA结合蛋白CUGBP1(CUG triplet repeat,RNA binding protein 1,CUGBP1)的结构和已知的生物学功能。在此基础上,我们展开了通过CUGBP1靶向肝星状细胞活化改善肝纤维化的作用和机制研究。在第二章首先检测了病人肝纤维化组织中CUGBP1的表达,并确定了CUGBP1的表达与患者肝组织纤维化程度成正比。用促肝纤维化细胞因子TGF-β刺激人肝星状细胞株LX2和小鼠原代肝星状细胞,Q-PCR和Western结果分别显示TGF-β刺激后肝星状细胞中CUGBP1的mRNA和蛋白水平均上调。在此基础上检测LX2细胞中肝星状细胞活化的标志物α-SMA和collagen 1的表达,发现TGF-β刺激后肝星状细胞活化。敲低CUGBP1后,TGF-β刺激条件下LX2细胞中α-SMA的表达明显低于对照组,说明CUGBP1促进肝星状细胞活化。另外敲低CUGBP1的LX2细胞中IFN-γ的表达和分泌均上调。Ki-67染色检测LX2细胞的增殖,发现敲低CUGBP1不影响LX2细胞的增殖。乳酸脱氢酶法检测人肝细胞株L02和小鼠原代肝细胞用siRNA-CUGBP1敲低CUGBP1后细胞的增殖,结果显示敲低CUGBP1不影响肝细胞的增殖。Annexin V-FITC染色后用流式细胞仪检测LO2细胞和小鼠原代肝细胞的凋亡,敲低CUGBP1的肝细胞中Annexin V-FITC阳性细胞的比例与对照相同,CUGBP1不影响肝细胞凋亡。综上可得敲低CUGBP1可以抑制肝星状细胞的活化,而并不影响肝细胞和肝星状细胞的增殖。LX2细胞中敲低CUGBP1后用TGF-β刺激12 h或24 h后均检测到细胞中p-STAT1、p-Smad2和Smad7的上调。TGF-β刺激环境中IFN-γ单克隆抑制剂可以促进LX2细胞的活化并消除CUGBP1对LX2细胞活化的促进作用。STAT1突变的人成纤维细胞株U3A中敲低CUGBP1不影响细胞表达α-SMA。由此可得出结论CUGBP1通过抑制IFN-γ的分泌来促进HSC的活化。基于CUGBP1的已知功能,我们推测CUGBP1有可能作用于IFN-γ mRNA。为了验证以上猜想,我们合成了含有IFN-γ mRNA 3’端非编码区GRE序列的探针IFN-γ-GRE-Bio。Pull-down和竞争实验都证明CUGBP1能够结合到IFN-γ mRNA 3’端非编码区GRE序列上。LX2细胞中敲低CUGBP1后用放线菌酮D抑制细胞中mRNA的合成,发现敲低CUGBP1后细胞中IFN-γ mRNA的稳定性明显增加。以上结果证明CUGBP1通过靶向IFN-γ mRNA的降解促进LX2细胞活化。第三章中我们找到了能够靶向CUGBP1的小分子化合物梣酮。免疫荧光实验证明小分子化合物梣酮能够抑制活化的LX2细胞中CUGBP1的表达。蛋白和基因水平检测梣酮对LX2细胞中α-SMA和collagen 1的表达的影响,结果显示梣酮明显抑制LX2细胞的活化。用siRNA敲低LX2细胞中CUGBP1后小分子化合物梣酮对LX2细胞活化的抑制作用消失,说明梣酮是通过下调CUGBP1抑制LX2细胞活化的。在小鼠胆管结扎(BDL)小鼠肝纤维化模型中梣酮剂量依赖性地改善小鼠肝纤维化。在给予梣酮的小鼠肝组织中检测到CUGBP1、α-SMA的下调和HSC中IFN-γ上调。由此说明通过靶向CUGBP1抑制HSC活化可以作为改善或治疗肝纤维化的方法。综上所述,CUGBP1可以促进HSC活化,小分子化合物梣酮下调CUGBP1抑制HSC活化,改善BDL诱导的小鼠肝纤维化。靶向CUGBP1可能成为肝纤维化治疗新的策略。本文不仅揭示了 CUGBP1在肝纤维化中的作用,还为肝纤维化治疗提供新的潜在靶点。

关键词：肝纤维化梣酮实验药理靶向肝星状细胞 CUGBP1蛋白转化生长因子β

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