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基于序列特异性DNA结合蛋白靶向捕获DNA的研究

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基于序列特异性DNA结合蛋白靶向捕获DNA的研究

作者：夏强东南大学

学位级别：硕士

靶向富集(Target Enrichment)技术广泛应用于医学诊断和生物学领域,尤其是基因测序行业。相比于只对基因组某些位置的研究来说,全基因组测序是一项既耗时又昂贵的“大工程”,而如今的二代测序(NGS)技术越来越依赖于从复杂样本中快速准... 详细信息

靶向富集(Target Enrichment)技术广泛应用于医学诊断和生物学领域,尤其是基因测序行业。相比于只对基因组某些位置的研究来说,全基因组测序是一项既耗时又昂贵的“大工程”,而如今的二代测序(NGS)技术越来越依赖于从复杂样本中快速准确地获得特定数据的能力。靶向富集技术针对外显子等特定区域进行靶向富集,在相同测序通量下可以获得更大的DNA测序深度,节省大量的时间和成本。本课题利用CRISPR/Cas系统的靶向特异性,开发了一种简单快速、高效特异的靶向富集新方法——CRISPR辅助靶向富集(CRISPR assisted target enrichment,CATE)。为了探究该方法的可靠性,首先针对ATK1、BRAC1、TP53 3个基因外显子设计28条captured sgRNA(csgRNA);利用dCas9/csgRNA复合物对Tn5转座酶片段化293T细胞基因组DNA中的3个基因外显子位置精准定位后采用生物素-链霉亲和素系统将目标DNA分离。对富集后的DNA片段进行克隆测序,结果显示80%的序列能够比对到csgRNA靶标区域,初步验证了CATE靶向富集特定DNA的可行性。为初步探究CATE方法的应用范围,对186个基因外显子共设计367条csgRNA,对食管癌患者和健康人的血液游离DNA(cfDNA)富集后进行高通量测序。结果显示CATE能够将cfDNA样本中仅占0.12%的目的外显子区域,最高提升至94.47%,表明CATE可有效用于cfDNA的靶向富集测序。为揭示食管癌患者与健康人cfDNA突变情况的差异,针对450个基因设计2302条csgRNA用于食管癌患者和健康人cfDNA的CATE靶向富集测序及突变分析。结果表明CATE能够将仅占0.05%的目的外显子区域,最高提升至97.89%。并且发现了39种可能与食管癌发病具有潜在关联性的基因突变位点信息。本研究开发出了一种新型的基于CRISPR的捕获方法,并应用于游离DNA的靶向捕获测序,丰富了cfDNA液体活检的检测方法。通过该方法,本研究共对29例样本进行了分析,表明该方法能够对食管癌患者游离DNA中的突变情况进行精确的鉴定,为食管癌的突变检测提供了新方法。

关键词：靶向捕获 CRISPR/Cas dCas9 二代测序

全外显子及靶向文库捕获测序在多囊肾病基因诊断中的应用比较

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分子诊断与治疗杂志 2017年第5期9卷 301-307页

作者：刘维强张慧敏李浩贤孙筱放广州医科大学附属第三医院广东省产科重大疾病重点实验室广东省普通高校生殖与遗传重点实验室广东广州510150

目的比较全外显子和靶向文库捕获高通量测序对多囊肾病相关基因的检测效率。方法对6份多囊肾病标本(包括一份低比例嵌合变异标本)分别进行全外显子捕获或靶目标捕获2种方法建立文库,Illumina Hi Seq 2000仪器连续双向测序。结果以PKD1、... 详细信息

目的比较全外显子和靶向文库捕获高通量测序对多囊肾病相关基因的检测效率。方法对6份多囊肾病标本(包括一份低比例嵌合变异标本)分别进行全外显子捕获或靶目标捕获2种方法建立文库,Illumina Hi Seq 2000仪器连续双向测序。结果以PKD1、PKD2和PKHD1 3个基因作为目标序列,靶向捕获法平均测序深度为190倍,5倍以上测序深度占全部有效序列的85.59%,靶区域覆盖度95%以上,但PKD1第一外显子仍有200~300 bp区域不能覆盖;全外显子捕获法平均测序深度为28.34倍,5倍以上测序深度占全部有效序列的55.35%,目标区域覆盖度较低,PKD1外显子覆盖度小于40%。结论靶向文库捕获测序法具有较髙的敏感性、准确性,更适合PKD基因变异的检测,但高通量测序技术对PKD1基因检测仍有不足之处。

关键词：多囊肾病靶向捕获全外显子

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绵羊40K液相基因芯片的开发与应用

绵羊40K液相基因芯片的开发与应用

作者：郭应威西北农林科技大学

学位级别：硕士

大规模基因分型是绵羊全基因关联分析(Genome whole association study,GWAS)和基因组选择育种(Genome selection,GS)等研究的重要基础,利用传统的固相芯片进行分型存在位点一经确定则无法增删、获取SNP数量有限等问题。液相芯片基于靶... 详细信息

大规模基因分型是绵羊全基因关联分析(Genome whole association study,GWAS)和基因组选择育种(Genome selection,GS)等研究的重要基础,利用传统的固相芯片进行分型存在位点一经确定则无法增删、获取SNP数量有限等问题。液相芯片基于靶向捕获测序技术,对目标位点及其周围DNA片段富集后进行建库和测序,其测序深度高,设计灵活,成本较低,使得绵羊更大规模基因分型成为可能。因此,设计一款基于捕获测序的绵羊液相芯片可以以更低的成本、更准确的结果进行大规模分型,从而更好地服务于绵羊育种领域。本研究利用全世界64个品种共551只绵羊及36只绵羊野生近缘种(野绵羊)的重测序数据,结合选择信号、动物QTL数据库、已报道重要功能位点等多种信息,设计了一款基于靶向捕获测序的绵羊液相芯片。主要研究结果如下:(1)该芯片共包含40156个标记位点,其中填充位点34415个,功能位点5741个。芯片位点在全基因组均匀分布,平均间距为64.4K。(2)利用该芯片对323只湖羊和东佛里生绵羊杂交F2代(东湖羊)进行基因分型,过滤后共检测到209625个高质量SNPs,目标位点平均捕获效率为99.7%,目标位点平均测序深度为70X,在所检测出的SNP中,最小等位基因频率大于5%的位点共209,026个。(3)采用上述数据对东湖羊进行GWAS,结果验证了与羊毛类型相关的IRF2BP2基因,此外,还找到了ARHGAP21和KIAA1217基因之间与乳头数性状相关的区域。综上,本研究设计了一款基于捕获测序的绵羊40K液相芯片,具有功能位点丰富、分型准确、成本低廉等优点,对东湖羊GWAS结果也证明了利用该芯片进行相关研究的可靠性。相信随着芯片位点的不断优化升级,将使得相关研究更加准确和高效,进而更好地服务于绵羊分子育种工作。

关键词：芯片设计靶向捕获 GWAS 绵羊育种

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牛海拔适应的基因位点发掘与液相芯片创制

牛海拔适应的基因位点发掘与液相芯片创制

作者：展亚楠云南农业大学

学位级别：硕士

西藏黄牛改良始于上世纪80年代,目前西藏改良奶牛（荷斯坦♂×西藏牛♀）级进杂交已进行到F代以上,随着改良代次增加,其高原适应性明显降低,死亡率达20%左右,产奶量仅2300多公斤。因此,目前必须开展改良群体的横交固定和世代选育,保留... 详细信息

西藏黄牛改良始于上世纪80年代,目前西藏改良奶牛（荷斯坦♂×西藏牛♀）级进杂交已进行到F代以上,随着改良代次增加,其高原适应性明显降低,死亡率达20%左右,产奶量仅2300多公斤。因此,目前必须开展改良群体的横交固定和世代选育,保留西藏牛高原适应的优良血统。本研究拟通过连续海拔黄牛的群体基因组学分析,挖掘藏黄牛高原适应位点,并创制低成本高通量基因分型液相芯片,为高原耐受个体的快速精准选育提供分子手段。研究结果如下:首先,本研究选择500 m（盈江、大麦地）、1500 m（腾冲）、2500 m（丽江）、3000 m（迪庆）黄牛及3500 m（工布江达）黄牛5个海拔梯度黄牛为研究对象,通过F（3500-500 m）、MEMEA和Bay Pass三种分析方法进行群体基因组学分析,筛选到海拔关联位点10108个。使用黄牛参考基因组ARS-UCD1.2对筛选到的位点进行注释及富集分析,富集到38个KEGG显著通路,436个相关通路基因,其中PIK3R5、VASP、EFNA5、NFATC4、CREB3、SPP1、CAMK2B和LAMP3 8个基因与低氧显著相关。其次,本研究基于筛选到的10108个海拔关联位点,结合动物QTL数据库以及奶牛芯片制作必需的填充位点,创制了一款基于靶向捕获测序的奶牛低氧功能液相芯片（10K,彦星1号）。该芯片包括低氧相关功能位点10108个,奶牛芯片填充位点3552个,两者核对去重后共11637个位点。最后,本研究利用该芯片对1551头西藏改良牛进行基因分型,过滤后共检测到10138个高质量SNPs,目标SNPs平均捕获效率相对较高,为87.12%,目标SNPs平均测序深度5×。同时,结合西藏改良牛血液生理指标进行GWAS分析,结果发现与HIF及相关通路有关基因CRTC3、GADD45A和MZF1,未筛选到与血液生理表型明显相关的基因。研究结果表明芯片的海拔关联位点与造血功能关联显著性不大,需要扩大心、肺等适应性指标进一步研究。综上,本研究通过连续海拔黄牛的群体基因组分析,筛选到海拔关联基因和位点,并基于这些位点创制了一款牛低氧功能液相芯片（10K）,该芯片具有分型准确、成本廉价、功能位点丰富的优点,利用该芯片开展西藏改良牛血液生理指标GWAS研究案例,结果证明了该芯片的可靠性。该芯片可直接用于高原改良奶牛的横交固定和世代选育。

关键词：低氧适应液相芯片靶向捕获西藏改良牛 GWAS

遗传性胆红素代谢障碍与胆汁淤积NGS方法的建立及应用

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生物技术进展 2022年第4期12卷 591-599页

作者：宋燚贾思雨武丽娜张伟欧晓娟黄坚首都医科大学附属北京友谊医院临床医学研究所北京100050 北京大学人民医院麻醉科北京100044 首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心北京100050

为快速准确、低成本、高通量地检测我国人群常见的遗传性胆红素代谢障碍及胆汁淤积综合征,选择了10个易感基因的全部外显子及内含子剪切区的SNP/CNV,建立了基于二代测序技术(next generation sequencing,NGS)的靶向捕获测序方法。通过6... 详细信息

为快速准确、低成本、高通量地检测我国人群常见的遗传性胆红素代谢障碍及胆汁淤积综合征,选择了10个易感基因的全部外显子及内含子剪切区的SNP/CNV,建立了基于二代测序技术(next generation sequencing,NGS)的靶向捕获测序方法。通过6例已知突变位点的样本对该方法的准确性进行验证,准确率为100%。收集首都医科大学附属北京友谊医院遗传性胆红素代谢障碍及胆汁淤积综合征患者39例进行检测,共检测到58种突变。检测结果与HGMD、ClinVar、OMIM突变数据库比较,未报道的突变通过千人基因组数据集对比并按照哈温平衡检验(HWE_P>0.05)和χ^(2)检验确定新突变19种。检测到的不同突变类型有效地揭示了该类疾病的遗传多样性。NGS方法的建立及应用为临床诊断提供了新的技术手段。

关键词：遗传性胆红素代谢障碍胆汁淤积二代测序技术靶向捕获

目标基因捕获测序技术检测1例肥厚型心肌病致病基因突变

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临床检验杂志 2014年第5期32卷 333-336页

作者：刘旭霞姜腾勇郭俊郑帅王绿娅杜杰首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所心血管重塑相关疾病教育部重点实验室首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所心内科北京100029

目的通过靶向捕获高通量测序技术初步筛查肥厚型心肌病(HCM)致病基因突变。方法收集1例HCM患者临床信息和外周血,并提取基因组DNA,制备DNA全基因组文库。挑选导致HCM的8个候选基因,用GenCap基因序列捕获技术靶向富集该患者外周血DNA候... 详细信息

目的通过靶向捕获高通量测序技术初步筛查肥厚型心肌病(HCM)致病基因突变。方法收集1例HCM患者临床信息和外周血,并提取基因组DNA,制备DNA全基因组文库。挑选导致HCM的8个候选基因,用GenCap基因序列捕获技术靶向富集该患者外周血DNA候选基因并行高通量测序。通过生物信息学分析筛选致病突变。用Sanger测序来验证相应致病基因突变位点。结果目标基因靶向捕获测序结果经与公共数据库和内部健康人测序数据库对比,发现致病基因突变位点MYBPC3 D770N,该致病基因突变与Sanger测序结果一致。结论用目标基因靶向捕获测序技术可实现对HCM致病基因突变的初步筛查,对HCM的临床基因诊断具有潜在的应用价值。

关键词：肥厚型心肌病突变靶向捕获高通量测序

PPP1R3A基因多态性与中国维吾尔族人群精神分裂症关联性研究

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中国神经精神疾病杂志 2019年第6期45卷 356-360页

作者：史新玉安治国孙乐乐徐斌母代斌傅松年胡红星罗晓杜雯闫萍靳路聂丹考尔沙尔·艾力木师咏勇伊琦忠新疆医科大学第一附属医院心理医学中心乌鲁木齐830054 新疆医科大学健康管理院

目的探索蛋白磷酸酶1调节亚基3A(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A, PPP1R3A)基因外显子区域基因位点多态性与中国维吾尔族人群精神分裂症的关联性。方法利用多重PCR靶向捕获二代测序技术对528例维吾尔族精神分裂症患者及57... 详细信息

目的探索蛋白磷酸酶1调节亚基3A(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A, PPP1R3A)基因外显子区域基因位点多态性与中国维吾尔族人群精神分裂症的关联性。方法利用多重PCR靶向捕获二代测序技术对528例维吾尔族精神分裂症患者及576名维吾尔族正常对照进行PPP1R3A基因外显子区域DNA扩增,Illumina HiSeq X Ten平台进行高通量测序,用阳性与阴性症状量表(positive and negative symptoms scale, PANSS)评估患者病情严重程度。结果患者组与对照组之间PPP1R3A基因rs1800000位点等位基因和基因型频率差异有统计学意义(P<0.05);rs1799999位点基因型频率在女性患者组与对照组间差异有统计学意义(P<0.05);rs8192686位点在男性患者组与对照组间等位基因频率差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PPP1R3A基因rs1800000位点多态性可能与中国维吾尔族人群精神分裂症的发生发展存在关联性;rs1799999位点多态性可能与中国维吾尔族女性精神分裂症的发病有关联性;rs8192686位点C等位基因可能与中国维吾尔族男性精神分裂症发病有关联性。

关键词：精神分裂症 PPP1R3A基因靶向捕获关联性研究

PPP1R3A基因多态性与中国维吾尔精神分裂症的关联性研究

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PPP1R3A基因多态性与中国维吾尔精神分裂症的关联性研究

作者：史新玉新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:探索PPP1R3A基因多态性与中国新疆维吾尔人群精神分裂症的关联性。方法:利用多重PCR靶向捕获二代测序技术对528例维吾尔精神分裂症病人及576例维吾尔正常对照进行PPP1R3A基因外显子区域DNA扩增,采用适合于DSM-IV的结构式临床访谈(S... 详细信息

目的:探索PPP1R3A基因多态性与中国新疆维吾尔人群精神分裂症的关联性。方法:利用多重PCR靶向捕获二代测序技术对528例维吾尔精神分裂症病人及576例维吾尔正常对照进行PPP1R3A基因外显子区域DNA扩增,采用适合于DSM-IV的结构式临床访谈(SCID)对病例组患者进行病史收集和精神状况检查,阳性与阴性症状量表(PANSS)来判定维吾尔精神分裂症患者精神症状的严重程度,Illumina HiSeq X Ten平台进行高通量测序,利用PLINK、SPSS 22.0软件进行统计分析。结果:PPP1R3A基因rs1800000位点在病例组与对照组中等位基因和基因型频率差异有统计学意义(P<0.05);rs1799999位点在女性病例组与对照组间基因型频率差异有统计学意义(P<0.05);rs8192686位点在男性病例组与对照组间等位基因频率差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PPP1R3A基因rs1800000位点可能与中国新疆维吾尔人群精神分裂症的发生发展存在关联性;rs1799999位点AA基因型频率的降低和AC基因型频率的升高可能与新疆维吾尔女性精神分裂症的发病有关联性;rs8192686位点C等位基因可能与维吾尔男性精神分裂症有关联性。

关键词：精神分裂症 PPP1R3A基因靶向捕获关联性研究

GABBR2基因多态性与中国维吾尔精神分裂症的关联性研究

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GABBR2基因多态性与中国维吾尔精神分裂症的关联性研究

作者：郑东晨新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨GABBR2基因rs10985811位点与新疆维吾尔族精神分裂症患者易感性的关系。方法:本次实验以新疆维吾尔人群为研究对象,并通过病例-对照的试验方法,分别纳入病例组602例维吾尔族精神分裂症患者和对照组672例维吾尔族健康人群。对... 详细信息

目的:探讨GABBR2基因rs10985811位点与新疆维吾尔族精神分裂症患者易感性的关系。方法:本次实验以新疆维吾尔人群为研究对象,并通过病例-对照的试验方法,分别纳入病例组602例维吾尔族精神分裂症患者和对照组672例维吾尔族健康人群。对其生物学资料进行靶向捕获及测序,并使用相关统计方法,得到相关结果。结果:病例组与对照组的年龄水平(t=-0.681,P=0.496)及性别构成(χ=1.192,P=0.275)无异质性的前提下,使用相关软件平台分析得出该位点分布均符合哈迪-温伯定律。并在随后的研究中得出GABBR2位点rs10985811等位基因(χ=0.021,P=0.884)及基因型(χ=0.467,P=0.494)分布在新疆维吾尔人群精神分裂症中无统计学意义。该位点不同性别之间等位基因(χ=0.165,P=0.683)及基因型(χ=3.073,P=0.215)分布在新疆维吾尔人群精神分裂症中无统计学意义。该位点在新疆维吾尔人群精神分裂症首发年龄方面,不同基因型之间有显著差异(F=5.254,P=0.005)。结论:GABBR2基因rs10985811位点与新疆维吾尔精神分裂症不存在关联性,不是精神分裂症发病的危险因素。这次研究进一步扩大了新疆维吾尔人群精神分裂症的生物样本库和临床资料库,为今后更加深入的研究维吾尔人群精神分裂症提供了更好的条件。

关键词：精神分裂症 GABBR2基因靶向捕获关联性研究