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非肌肉肌球蛋白ⅱ型重链a羧基端蛋白的真核表达及在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞中的作用

畜牧兽医学报 2012年第9期43卷 1455-1462页

作者：吕军华刘宁宁赵钦马玉萍张冲王向鹏胡守彬赵菲菲吴海珍肖一红周恩民山东农业大学动物医学院泰安271018 西北农林科技大学兽医免疫学研究所西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

前期研究结果证明抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的抗独特型抗体特异性结合Marc-145细胞上的非肌肉肌球蛋白ⅱ型重链a(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A,NMHCⅡ-A)蛋白,其结合位点位于NMHCⅡ-A的羧基端。本研究通过真核表达N... 详细信息

前期研究结果证明抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的抗独特型抗体特异性结合Marc-145细胞上的非肌肉肌球蛋白ⅱ型重链a(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A,NMHCⅡ-A)蛋白,其结合位点位于NMHCⅡ-A的羧基端。本研究通过真核表达NMHCⅡ-A的羧基端(PRA)蛋白,验证其对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达PRA蛋白。Western blot和间接免疫荧光鉴定PRA蛋白的表达及其与Marc-145细胞的结合。通过病毒中和试验、荧光聚焦中和试验和荧光定量PCR检测PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。Western blot和间接免疫荧光结果表明,PRA蛋白在真核细胞中得到成功表达,其最高表达量为接种1个MOI杆状病毒后96h时。PRA蛋白特异性结合Marc-145细胞,使PRRSV感染Marc-145细胞延迟24h并且感染效率降低60%。真核表达的NMHCⅡ-A羧基端蛋白能特异性结合Marc-145细胞并有效降低PRRSV的感染。这些结果为进一步阐明NMHCⅡ-A在PRRSV感染细胞过程中的作用提供了新的依据。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒非肌肉肌球蛋白ⅱ型重链a 杆状病毒抑制作用

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PiggyBac转座子介导的过表达NMHCⅡ-A羧基端蛋白（PRA） MARC-145细胞系的建立及其对PRRSV感染的影响

PiggyBac转座子介导的过表达NMHCⅡ-A羧基端蛋白（PRA） MARC-145...

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作者：魏蕊芳西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)属于尼多病毒目家族的动脉炎科属。由该病毒诱发的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是目前危害世界养猪业的重要病毒性传染病之一,主要引起妊娠母猪流产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍性疾病以及各年龄段猪的呼吸道疾病,导致猪群的高死亡率。PRRSV具有典型的宿主细胞嗜性,这种细胞嗜性是由细胞上的病毒受体决定的。这是由于PRRSV感染宿主细胞的第一步是与细胞膜表面的受体结合,然后在受体的介导下才能完成感染过程。目前常用于体外研究PRRSV的细胞模型是MARC-145细胞系,该细胞上参与PRRSV感染的受体主要有肝素样分子、波形蛋白、CD151和CD163。PRRSV感染MARC-145细胞时,首先由肝素样分子吸附PRRSV,随后由波形蛋白结合核衣壳N蛋白来帮助其在细胞内的运输,CD151可能参与了病毒囊膜与胞内体的融合,而CD163对其感染也是必需的,但作用尚不清楚。我的导师周恩民教授制备了针对PRRSV GP5的单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2,并利用该单抗在MARC-145细胞上发现了一个可能的PRRSV细胞受体：非肌肉肌球蛋白ⅱ型重链a (non-muscle myosin heavy chain Ⅱ-A, NMHC Ⅱ-A)它属于非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链(NMHC Ⅱ)的一个亚型,主要参与细胞的迁移、吸附、形态变化以及胞质分裂等过程。目前有研究证明,NMHC Ⅱ-A可以作用于T细胞上的趋化因子受体,介导趋化因子的信号传导;NMHC Ⅱ-A还可以作为单纯疱疹病毒Ⅰ型的细胞受体介导病毒进入细胞。目前对NMHC Ⅱ-A作为PRRSV细胞受体功能的验证尚在进行中。本研究团队前期证明Mab2-5G2结合NMHC Ⅱ-A的羧基端部分,并扩增获得了951bp的编码其羧基端基因的区域,将这段基因编码的产物命名为PRA。本课题主要研究在MARC-145细胞中稳定表达PRA对PRRSV感染的影响。首先通过PCR方法从pMD18-T-PRA载体中扩增得到编码PRA的基因片段,并在其5’端加入HA标签序列。用Xba Ⅰ和Not Ⅰ限制性内切酶将PRA基因片段定向克隆连接至PiggyBac真核表达载体。将测序正确的重组质粒PB-CMV-PRA-EF1 a-GFP-Puro和表达PB转座酶质粒pA共转染至MARC-145细胞,用嘌呤霉素和绿色荧光蛋白持续筛选至得到阳性细胞。将RT-PCR、间接免疫荧光试验和Western blot鉴定为阳性的细胞命名为MARC-145-PRA。同时构建稳定表达禽戊型肝炎病毒ORF2蛋白的MARC-145-ORF2细胞系作为对照。通过CPE观察和病毒滴度测定等方法检测PRRSV正常感染MARC-145-PRA细胞和对照细胞的差异,发现稳定表达PRA对PRRSV感染具有抑制作用;进一步利用荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)方法和激光共聚焦显微镜检测了稳定表达PRA对PRRSV内吞和吸附的影响,结果表明稳定表达PRA可以抑制病毒的内吞和吸附。利用MARC-145-PRA细胞系进行免疫共沉淀试验证明PRA可以结合NMHC Ⅱ-A,推测正是由于这种结合竞争性地抑制了NMHC Ⅱ-A和CD163结合,从而降低了病毒的感染量。综上所述,本研究对非肌肉肌球蛋白ⅱ型重链a羧基端蛋白PRA在PRRSV感染MARC-145细胞过程中的作用进行了研究。利用PiggyBac转座子载体系统筛选了稳定表达PRA的MARC-145细胞系,病毒感染试验结果表明PRA对PRRSV感染MARC-145细胞具有一定的阻断作用,说明PRA可以作为PRRSV潜在的细胞受体阻断剂。本研究为PRA蛋白在PRRSV感染宿主细胞过程中的作用研究奠定了一定的理论基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒非肌肉肌球蛋白ⅱ型重链a PRA PiggyBac转座子病毒受体

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抗独特型抗体鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒新型细胞受体

抗独特型抗体鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒新型细胞受体

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第九届全国免疫学学术大会

作者：高继明周恩民西北农林科技大学动物医学院

研究背景:猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV]属于动脉炎病毒属有囊膜的单股正链RIgA病毒。病毒细胞受体是介导病毒感染宿主细胞的关键因素。目前已知的参与PRRSV感染的细胞分子有硫酸乙酰肝素蛋白多糖一类肝素分子,唾液酸粘附素,CD163,波... 详细信息

研究背景:猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV]属于动脉炎病毒属有囊膜的单股正链RIgA病毒。病毒细胞受体是介导病毒感染宿主细胞的关键因素。目前已知的参与PRRSV感染的细胞分子有硫酸乙酰肝素蛋白多糖一类肝素分子,唾液酸粘附素,CD163,波形蛋白,CD151。作为PRRSV不同的细胞受体,虽然在病毒感染过程中发挥着重要的作用,但是这种作用并不能够单独完成病毒的侵染过程,因此PRRSV的感染需要多种细胞受体的介导并通过多条途径来完成。我们前期研究结果发现,PRRSV感染诱导宿主产生针对PRRSV GP5抗原的自身抗独特型抗体,利用抗GP5抗原的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2)从Marc一145和PAM细胞中沉淀出一个分子量为230kD的蛋白。研究方法:利用Mab2-5G2通过免疫共沉淀沉淀、质谱测序分析获得并鉴定与Mab2-5G2相互作用的细胞蛋白。为进一步明确目的蛋白与PRRSV GP5的关系,我们通过构建GP5稳定表达细胞系并利用免疫共沉淀及共聚焦定位等方法确定GP5与细胞蛋白的关系。为研究目的蛋白与GP5蛋白作用关系在PRRSV感染过程中的作用,利用原核表达纯化的细胞蛋白制备抗血清,利用抗血清进行病毒阻断实验。另外,通过RNAi及过表达的技术分别在Marc-145细胞内敲低或高表达该目的蛋白,通过TCID50、real time RT-PCR及Western blot等技术测定病毒对该细胞的感染滴度。研究结果:利用Mab2-5G2通过免疫共沉淀及质谱测序鉴定得出的蛋白为非肌肉肌球蛋白ⅱ型重链a(NMHCⅡ-A)。利用构建的稳定表达GP5蛋白的Marc-145细胞,我们证明NMHCⅡ-A与GP5蛋白结合,细胞内共定位结果显示NMHCⅡ-A与GP5在细胞内存在共定位关系。通过免疫小鼠制备的抗NMHCⅡ-A的高免血清能够剂量依赖性阻断PRRSV感染Marc-145细胞。细胞内敲低NMHCⅡ-A蛋白表达明显降低PRRSV对Marc-145细胞的感染,细胞内高表达NMHCⅡ-A蛋白显著增强PRRSV对Marc-145细胞的感染。结论:利用抗PRRSV GP5的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2)鉴定出PRRSV GP5蛋白的一个重要细胞受体蛋白NMHCⅡ-A。

关键词：抗独特型抗体细胞受体 PRRSV 非肌肉肌球蛋白ⅱ型重链a

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