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基于表面增强拉曼光谱法的新型高灵敏度核酸传感器

基于表面增强拉曼光谱法的新型高灵敏度核酸传感器

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作者：郑福卫青岛科技大学

学位级别：硕士

本文构建了几种新型的核酸放大策略,并与高灵敏度的表面增强拉曼散射分析方法结合,构建了三种新型的SERS放大检测方法：基于DNA滚环聚合和滚环转录的循环放大方法、基于DNA自组装引发的非线性杂交的SERS放大方法、基于熵驱动引发的转录... 详细信息

本文构建了几种新型的核酸放大策略,并与高灵敏度的表面增强拉曼散射分析方法结合,构建了三种新型的SERS放大检测方法：基于DNA滚环聚合和滚环转录的循环放大方法、基于DNA自组装引发的非线性杂交的SERS放大方法、基于熵驱动引发的转录和非线性树枝状杂交联合的DNA循环放大方法,实现了对miRNA的高灵敏度、高选择性检测。主要内容包括以下几个方面：1、构建滚环聚合和滚环转录联用的复合核酸反应放大机制,表面增强拉曼的方法检测miRNA,实现了miRNA的高灵敏度、高选择性、快速检测。滚环聚合和滚环转录各提供一个层次的放大,设计了一个单链环状DNA结构作为探针,该探针包括以下功能片段：“引发位点”：特异性识别目标miRNA;"引物结合位点”：动态的与引物互补的片段,在初始阶段是被“锁住”的,与“识别位点”互补配对;“识别位点”：后面序列的打开会引起前面序列的打开;“孔雀石绿适体模板”：与孔雀石绿的RNA适体互补的DNA片段;“剪切位点”：切克内切酶剪切序列的单链,与其互补的序列结合后,形成功能化的双链剪切位点;“启动位点”：功能化双链T7启动子的单链。靶标miRNA由“引发位点”特异性识别,并利用环形单链探针的各功能片段,引发滚环聚合阶段、中间阶段、滚环转录阶段一系列放大反应依次发生,产生实现了靶miRNA的循环利用和滚环聚合和滚环转录的联合放大,检测限可达10-16M。中间阶段被证明是产生低检测限所必需的。该方法具备区分靶标miRNA序列以及序列相近的其他miRNA序列的选择性,并可用于检测不同的肿瘤细胞或其他的肿瘤标志物。2、将基于核酸引发的非线性的杂交链式反应的放大策略与表面增强拉曼检测方法联用,以Trigger DNA引发,使预先制备的两种双链结构DNA组装单元连续自发地组装成带有罗丹明信号的树枝状结构,再通过金纳米粒子的增强,实现了对罗丹明的拉曼散射信号的放大。本方法的原料仅为DNA和杂交缓冲液,无需任何酶的参与,相比于滚环聚合和滚环转录联合SERS信号放大系统,其反应操作更加简单、快捷,且其本身具有较高的灵敏度。3、本章在第3章开发的新型树枝状杂交放大表面增强拉曼产生信号的检测方法的基础上,进一步结合基于熵驱动的靶循环放大方法,构建了复合放大检测体系。该方法利用miRNA引发制备好的探针的熵驱动的杂交,再通过聚合产生RNA转录的DNA模板链,结合RNA聚合酶、NTPs及其缓冲液,产生引发树枝状杂交的引发链,引发罗丹明修饰的DNA的链的自发杂交组装,再通过杂交附着纳米金颗粒,来实现罗丹明的拉曼信号的放大,力图实现靶miRNA信号的高灵敏度、高选择性检测。

关键词： miRNA 滚环聚合滚环转录非线性树枝状杂交表面增强拉曼散射肿瘤标志物

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