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作者：孟红恩新疆大学

学位级别：硕士

在植物界广泛存在的金属硫蛋白(Metallothioneins,MTs)是一类可与金属离子结合的、富含半胱氨酸残基(10-30%)的小分子蛋白,可以被众多非生物因素诱导产生,其所具有的强烈的清除自由基和结合重金属离子的能力使其成为植物研究的热点。盐... 详细信息

在植物界广泛存在的金属硫蛋白(Metallothioneins,MTs)是一类可与金属离子结合的、富含半胱氨酸残基(10-30%)的小分子蛋白,可以被众多非生物因素诱导产生,其所具有的强烈的清除自由基和结合重金属离子的能力使其成为植物研究的热点。盐穗木(Halostachys caspica)金属硫蛋白HcMT含有78个氨基酸,其中半胱氨酸数量为14个,理论分子量为7.70 k D,理论等电点为5.05。生物信息学分析结果显示,HcMT符合典型的植物Type 2型MT序列特征,通过MEGA 4.0系统进化树分析与其它一些Type 2型MT进化起源表明,其和海蓬子(Salicornia brachiata)的亲缘关系较近,氨基酸相似性达93%。为研究HcMT的功能活性,将HcMT基因亚克隆至p GEX-6p-2原核表达载体上,在大肠杆菌BL21中表达,分离纯化融白蛋白GST-HcMT,通过原子吸收分光光度法测定GST-HcMT结合金属离子的量以判断其与金属离子的结合能力。结果显示,诱导表达的GST-HcMT分子量在34 k D左右,与预期一致,且通过Western blot进一步得到验证;诱导的同时添加金属离子,分离纯化GST-HcMT与金属离子复合物后,原子吸收结果表明其具有结合Cu、Zn、Pb、Cd的能力,结合量分别是对照的25倍、10倍、4倍和2倍,结合能力大小依次是:Cu>Cd>Zn>Pb。同时发现,工程菌pGEX-6p-2-HcMT/BL21具有耐受HO、NaHCO、NaCO的能力。将其亚克隆至pET32a原核表达载体,*** BL21表达后分离纯化融合蛋白Trx A-HcMT,Western blot鉴定其活性。采取与GST-HcMT相同的研究策略,发现Trx A-HcMT与GST-HcMT相比可以特异性的结合更多的金属离子,如Cd、Co、Cu、Fe、Mg、Pb、Zn、Hg。在Cd、Cu、Zn胁迫下,含pET32a-HcMT/BL21的工程菌繁殖速度明显优于含pET32a/BL21的工程菌。GST-HcMT与Trx A-HcMT的这种差异,可能与标签蛋白中半胱氨酸残基含量相关。为初步探索HcMT工业化生产的可行性,通过单因素实验及20 L发酵罐放大培养优化了影响转盐穗木金属硫蛋白大肠杆菌发酵培养基的成分及其它因素。优化培养基为:每900 m L培养基含蔗糖4 g,酵母浸粉24 g,蛋白胨8 g;每100 m L磷酸缓冲液含KHPO 2.31g、KHPO?3HO 12.54 g,两部分分别灭菌后混合。蛋白表达条件为:乳糖6 mmol/L,诱导4 h。通过20 L发酵罐发酵培养,可使菌体量达到2.68 g/L,比摇瓶培养提高了31%,每克干重菌体结合的铜离子达到315.3 mg,比摇瓶培养提高了69%,适宜放大培养。为进一步研究HcMT基因的功能活性及其应用于植物修复的可行性,将HcMT构建至p CAMBIA1301植物表达载体,通过EHA105农杆菌介导浸染烟草。基因组PCR鉴定筛选到转p CAMBIA1301-HcMT烟草阳性植株,转HcMT基因烟草的各种非生物胁迫耐受性以及对不同金属离子的富集情况有待于进一步的研究。

关键词：盐穗木盐穗木金属硫蛋白HcMT 原核表达金属离子结合能力非生物胁迫耐受性转基因植物

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萱草乙二醛酶Ⅰ基因功能分析

萱草乙二醛酶Ⅰ基因功能分析

作者：谭雨馨上海应用技术大学

学位级别：硕士

乙二醛酶系统作为植物中一种有效的脱毒机制,可以去除环境胁迫下植物响应生物或非生物胁迫而产生的过量甲基乙二醛(MG),维持甲基乙二醛在细胞中的动态平衡。乙二醛酶I是乙二醛酶系统的主要成分,在植物非生物胁迫耐受性方面发挥着重要作... 详细信息

乙二醛酶系统作为植物中一种有效的脱毒机制,可以去除环境胁迫下植物响应生物或非生物胁迫而产生的过量甲基乙二醛(MG),维持甲基乙二醛在细胞中的动态平衡。乙二醛酶I是乙二醛酶系统的主要成分,在植物非生物胁迫耐受性方面发挥着重要作用。研究表明过量表达乙二醛酶基因可以提高植物对非生物胁迫的抗性,包括抗盐、干旱、重金属等。本研究以本氏烟草和萱草为实验材料,使用农杆菌介导的转化在烟草中过表达萱草乙二醛酶I(Hf Gl X I-I),并通过定量反转录聚合酶链式反应(q RT-PCR)验证;实验以萱草‘斯特拉’不同器官组织、以及氯化钠、氯化锌和干旱处理的叶片为材料,采用荧光定量PCR方法,检测其表达模式;对野生型和转基因烟草幼苗的乙二醛酶活力、甲基乙二醛和丙二醛含量等进行动态测定、分析和比较;综合上述结果研究萱草乙二醛酶基因的功能。主要内容包括以下四个部分。(1)通过之前克隆的萱草乙二醛酶I基因(Hf Gl X I-1),采用农杆菌介导遗传转化方法,获得过量表达萱草乙二醛酶基因的转基因烟草,并采用实时荧光定量PCR验证。(2)为了能够更好的研究萱草乙二醛酶基因的功能,以萱草的不同组织(根、茎、叶、花、大花蕾、小花蕾)为材料,进行了荧光定量PCR检测。探究萱草乙二醛酶的表达模式。(3)测定转基因烟草的乙二醛酶I活性;并分别用氯化钠、氯化锌、以及干旱胁迫处理转基因过量表达萱草乙二醛酶基因的植株后,测定转基因烟草植株的生理指标,以探究非生物胁迫下烟草过量表达萱草乙二醛酶基因的耐受性变化,以期阐明萱草乙二醛酶基因在植物中的功能,并为观赏植物的非生物胁迫耐受性提供可能的分子育种工具。(4)以萱草‘63#’自交后代为实验材料,测定萱草植株中乙二醛酶活力:将其以乙二醛酶活力高低划分成四个等级,把不同酶活力等级的萱草在含有不同浓度氯化锌的基质上培养,测定萱草植株在重金属胁迫下的乙二醛酶活力、蛋白含量、叶绿素以及丙二醛的含量等生理指标,探究萱草植株对重金属锌胁迫的耐受性和乙二醛酶活力的关系,为快速、准确选择耐重金属锌耐受的观赏植物提供参考。实验的主要结论如下:1.通过农杆菌介导的方法得到过量表达Hf Gl X I-1转基因的烟草植株,并通过q PCR验证。以萱草‘斯特拉’不同组织为材料,进行荧光定量PCR(q RT-PCR)。结果表明,Hf GLX I-1主要在萱草叶片中表达。另外,以萱草叶片为材料,在氯化钠、氯化锌和干旱条件等非生物逆境诱导条件下Hf GLX I-1的表达量显著高于对照的表达量。2.过量表达萱草乙二醛酶基因的转基因烟草植株中乙二醛酶活力显著高于野生型植株。进一步,为了确认乙二醛酶Ⅰ活性增加是否是由于Hf GLX I-1的过量表达,用T2代转基因烟草进行荧光定量PCR验证,表明Hf GLX I-1的表达水平在转基因株系中明显高于野生型,表明Hf GLX I-1确实编码了乙二醛酶I蛋白,起到乙二醛酶I的作用。3.以野生型和转基因株系烟草幼苗为材料,分别用氯化钠、氯化锌和干旱处理7d。结果表明,野生型植物处理后明显萎蔫甚至枯萎死亡,而转基因株系生长状态显然优于野生型,表明转基因植物对盐、重金属和干旱等胁迫条件具有更高的耐受性。此外,对上述材料分别用氯化钠、氯化锌和干旱处理1 d测定了甲基乙二醛(MG)含量,结果显示:在没有任何胁迫处理的情况下,转基因植物和野生型植物的MG水平没有差异;然而,氯化钠、氯化锌和干旱处理后MG水平分别增加了2.5倍、3.5倍和5.4倍。与野生型相比,胁迫处理后的转基因植株MG增量明显降低。4.实验采用将‘63#’萱草自交后代,按照乙二醛酶活力由低到高分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个等级,进行重金属锌耐受性实验。此外,将四个等级成熟萱草植株的充分展开叶片在氯化锌溶液(5mmol·LZn Cl)中浸泡5–7 d。萱草叶片随着重金属胁迫的增加而发黄枯萎,但乙二醛酶活力等级越高后代的叶片受重金属胁迫的程度越小。分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四组酶活力等级的萱草在含有5mmol·LZn Cl的基质上培养,发现酶活力高的株系表现出更高的叶绿素含量和较低的丙二醛(MDA)含量。以团队前期获得的过表达Hf GLX I-1转基因萱草为父本与不同品种杂交,将萱草品种‘斯特拉’与不同品种杂交后代作为对照,进一步探究过量表达Hf GLX I-1转基因萱草的杂交植株对重金属锌的耐受性。发现相比于对照,转基因萱草具有更好的重金属耐受性。本研究为进一步利用观赏植物萱草进行重金属污染土壤修复提供理论依据。

关键词：乙二醛酶萱草(Hemerocallis spp) 遗传转化烟草(Nicotiana benthamiana) 非生物胁迫耐受性

大豆耐盐基因GmZnF1和GmPK6的耐逆功能研究

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大豆耐盐基因GmZnF1和GmPK6的耐逆功能研究

作者：陈新山东大学

学位级别：硕士

植物的耐逆性是信号网络中多个基因相互作用、共同调控的结果,为了更好地理解植物耐逆性相关机制,有必要研究植物基因在非生物胁迫情况下的表达模式。利用基因芯片,本实验室建立了盐和非盐胁迫下的大豆基因表达图谱,比较了它们的表... 详细信息

植物的耐逆性是信号网络中多个基因相互作用、共同调控的结果,为了更好地理解植物耐逆性相关机制,有必要研究植物基因在非生物胁迫情况下的表达模式。利用基因芯片,本实验室建立了盐和非盐胁迫下的大豆基因表达图谱,比较了它们的表达差异,筛选出与耐盐胁迫有关的多个候选基因。本文从候选基因中克隆了一个锌指蛋白转录因子基因和一个蛋白激酶基因,对它们在耐逆性中的作用进行了研究。主要研究内容和结果包括：通过比较大豆盐及非盐胁迫下的基因表达差异,发现17个锌指蛋白家族基因和26个蛋白激酶家族基因在盐胁迫下上调表达。在上述上调表达的2类基因中筛选并克隆了1个锌指蛋白基因GmZnFl和1个蛋白激酶基因GmPK6,并进行了功能研究。 1GmZnF1的克隆与初步功能分析 1.1GmZnF1基因的芯片结果验证半定量RT-PCR分析表明,GmZnFl基因在盐胁迫下,表达量随着胁迫时间的延长,表达量逐渐增加。 1.2GmZnFl蛋白结构、性质及系统进化分析 GmZnF1基因编码的蛋白是典型的C2H2-ZnF蛋白,具有一个跨膜结构域,一个复杂性较低的区域和一个DPBB-1样结构域。GmZnF1蛋白的疏水性较强,推测可能含有跨膜结构域。GmZnFl和油菜RING型E3泛素连接酶的同源性较高（99.0%）,与拟南芥中玉山筷子芥锌指家族蛋白有同源性（48.0%）,并且与蒺藜苜蓿E3泛素蛋白连接酶有同源性（38.0%）。 1.3GmZnF1转录激活活性分析利用酵母转录激活体系证明该蛋白具有转录激活活性,从而佐证了该基因是转录因子。 1.4GmZnFI基因表达模式分析 qPCR结果表明GmZnFI在大豆的根、茎和花中表达量最高,在叶片和种子中表达量较低,且其表达受ABA、盐胁迫、干旱和冷胁迫的明显诱导,在盐和旱诱导条件下的上调表达尤其明显。 1.5GmZnF1的克隆及拟南芥过表达株系的获得从“圣豆9号”中首次分离了1个锌指蛋白基因CDS序列,命名为GmZnF1,序列长度分别为834bp,分别编码278个氨基酸。克隆GmZnF1基因CDS全长,构建植物过表达载体,并转化筛选拟南芥,得到该基因的过表达纯系植株。 1.6拟南芥GmZnF1过表达系的抗逆性分析通过比较不同盐浓度下的种子萌发率,发现随着盐浓度的梯度升高,拟南芥35S::GmZnF1系的萌发率高于野生型的趋势越来越明显。对不同盐浓度下主根平均长度的比较发现,含有150mM和200mM氯化钠的1/2MS培养基上,35S::GmZnF1系植株的数据比野生型的数值大。盐浓度梯度处理结果显示,过表达系植株的耐盐旱能力显著高于野生型对照组的植株。综上所述,GmZnF1在拟南芥中的异位表达提高了拟南芥的耐盐性。 1.7拟南芥35S::GmZnFl生理实验指标测定在2.0μM ABA,200mM NaCl,250mM甘露醇以及4.0℃冷胁迫条件下,转基因株系的SOD, POD, CAT,丙二醛和脯氨酸,与对照组相比均有不同程度的升高,揭示转基因系对这些逆境有一定的抗性,细胞结构更加稳定,膜系统不易降解。 1.8大豆转化与检测使用含有目的基因的表达载体的农杆菌,使用组培方法转化大豆,然后对T1代植株进行检测：其中的35S::GmZnF1阳性植株,利用CTAB法提取DNA,进行Southern Blot检测。结果表明,在收获的T1代植株300棵植株中,共有阳性植株6棵,阳性比例2.0%,检测为阳性植株中的该目的基因都是单拷贝插入基因组。 2GmPK6的获得与初步功能分析 2.1GmPK6基因的芯片结果验证 RT-PCR分析表明,GmPK6基因在盐胁迫下,表达量随着胁迫时间的延长而逐渐增加。 2.2GmPK6蛋白结构、性质及系统进化分析 GmPK6基因编码的蛋白蛋白激酶,属于LAMMER类型的亚家族。结果显不：GmPK6与Glycine max PKC-like, Arabidopsis thaliana AFC2, Arabidopsis thaliana FUS3和烟草PK12的同源性较高（～100.0%）,其次是与蓖麻AFC有同源性（43.0%）。 2.3GmPK6蛋白表达克隆含有酶切位点的基因GmPK6,使用pGEX GST4T-1载体构建重组载体,并且转化Rosseta菌株。PCR检测阳性菌株,二次活化后,取出适量菌液作为0hr对照组,其余菌液中加入IPTG（终浓度1.0mM）,28.0℃摇菌诱导目的蛋白表达,并且在3hr,6hr和8hr时间点分别取样。SDS-PAGE电泳表明,目的蛋白在3h开始表达,表达量随时间逐渐增多。 2.4GmP

关键词：大豆 GmZnF1 GmPK6 非生物胁迫耐受性大豆遗传转化

大豆耐逆基因GmMYB84和GmPM30的初步功能研究及无选择标记转化载体构建

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大豆耐逆基因GmMYB84和GmPM30的初步功能研究及无选择标记转化载...

作者：秦梦茵山东大学

学位级别：硕士

植物的耐逆性是由多基因控制的,这些基因构成了一个复杂的调控网络。因此对非生物胁迫下植物基因表达情况的研究有助于我们更全面的了解植物的耐逆机制。本实验室利用基因芯片技术,建立了大豆盐和非盐胁迫下的基因表达图谱,比较其基因... 详细信息

植物的耐逆性是由多基因控制的,这些基因构成了一个复杂的调控网络。因此对非生物胁迫下植物基因表达情况的研究有助于我们更全面的了解植物的耐逆机制。本实验室利用基因芯片技术,建立了大豆盐和非盐胁迫下的基因表达图谱,比较其基因表达差异,发掘参与耐盐胁迫的候选基因。本文从候选基因中克隆了一个MYB类转录因子基因和一个LEA蛋白基因,进行了初步功能研究。同时构建了一个双T-DNA载体建立了一个无选择标记转化体系,用于遗传转化研究。主要研究内容和结果包括：利用大豆基因芯片分析大豆盐诱导的基因表达图谱发现,有5573个探针发生了两倍以上的变化,占全部芯片的9.1%,其中2833个表现为上调,2740个表现为下调。其中MYB基因家族中有15个上调变化明显;LEA基因家族中有20个上调变化明显。从这两个基因家族中各挑选一个变化明显的基因进行克隆和功能研究。一、GmMYB84的克隆与初步功能分析1. GmMYB84基因的芯片结果验证半定量RT-PCR分析表明,GmMYB84基因在盐胁迫下,表达量随着胁迫时间的延长,表达量逐渐增加。2. GmMYB84蛋白结构、性质及系统进化分析GmMYB84基因编码的蛋白是典型的R2R3-MYB蛋白,具有两个MYB结构域从属于R2R3-MYB类蛋白的第20亚群。该蛋白是亲水性蛋白。3. GmMYB84转录激活活性分析利用酵母转录激活体系证明该蛋白具有转录激活活性。4. GmMYB84基因表达模式分析半定量RT-PCR结果表明GmMYB84在大豆的根和花中表达量最高,在茎、叶和种子中表达量较低,且其受盐胁迫和ABA的明显诱导,不受干旱和冷胁迫的诱导。***84的克隆及拟南芥过表达株系的获得克隆GmMYB84基因cds全长,构建植物表达载体,并转化拟南芥,得到该基因的过表达T2代纯系。***84拟南芥过表达系的耐盐性分析通过对不同盐浓度下种子萌发率比较发现,随着盐浓度的升高,过表达系的萌发率高于野生型的趋势越来越明显。通过对不同盐浓度下根长的比较发现,在含有150mM和200mM NaCl的1/2MS培养基上,过表达系植株的根长比野生型长。盐浓度梯度处理结果显示,过表达系植株的株高高于野生型。高盐胁迫处理结果显示,过表达系植株的存活率高于野生型。综上标明,GmMYB84在拟南芥中的异位表达提高了植株耐盐性。二.GmPM30的获得与初步功能分析***30基因的芯片结果验证RT-PCR分析表明,GmPM30基因在盐胁迫下,表达量随着胁迫时间的延长而逐渐增加。***30蛋白结构、性质及系统进化分析GmPM30基因编码的蛋白是亲水性蛋白,属于第四类LEA蛋白。***30表达模式分析半定量RT-PCR结果表明,GmPM30在大豆的根、花和种子中表达量最高,在茎和叶中几乎不表达;且GmPM30受盐、干旱、冷胁迫和ABA的明显诱导。***30的克隆及拟南芥转化克隆了GmPM30基因cds全长,构建了植物表达载体,并转化拟南芥,得到该基因的过表达纯系。***30拟南芥过表达株系系耐盐/旱/冷性分析不同盐浓度下种子萌发率比较发现,随着盐浓度的升高,过表达系的萌发率高于野生型的趋势越来越明显。不同盐浓度下根长的比较发现,在含有150mM和200mM NaCl的1/2MS培养基上,过表达系植株的根长比野生型长。高盐胁迫处理结果显示,过表达系植株的存活率高于野生型。干旱胁迫处理显示,GmPM30过表达系植株的存活率高于野生型。叶片失水率结果显示,GmPM30过表达系植株叶片的失水率低于野生型。GmPM30过表达系耐冷性分析结果显示,GmPM30过表达系植株没有表现出明显的耐冷性。三、无选择标记转化体系初步建立构建了一个农杆菌双元表达载体构建,该双元表达载体含有两个T-DNA边界,每个T-DNA边界内分别含有目的基因和抗性标记基因,用于大豆的遗传转化,所得后代中能够分离出不含抗性标记基因的转基因植株。

关键词：大豆 GmMYB84 GmPM30 非生物胁迫耐受性无选择标记转化体系

紫花苜蓿MsCDPK3基因的克隆及在非生物胁迫中的功能研究

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紫花苜蓿MsCDPK3基因的克隆及在非生物胁迫中的功能研究