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γ-谷氨酰转肽酶分子改造及其应用

γ-谷氨酰转肽酶分子改造及其应用

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作者：刘栓英江南大学

学位级别：硕士

γ-谷氨酰转肽酶(GGT)通过将L-Gln的γ-谷氨酰基团转移给受体底物,从而合成茶氨酸及苦味氨基酸衍生物,在食品及医药行业具有广泛应用。为了进一步提高GGT合成量和酶活力,本研究对GGT的表达元件和分子结构进行了优化改造。为提高产物产率... 详细信息

γ-谷氨酰转肽酶(GGT)通过将L-Gln的γ-谷氨酰基团转移给受体底物,从而合成茶氨酸及苦味氨基酸衍生物,在食品及医药行业具有广泛应用。为了进一步提高GGT合成量和酶活力,本研究对GGT的表达元件和分子结构进行了优化改造。为提高产物产率,本研究优化了重组GGT催化合成茶氨酸及γ-Glu-Phe的转化条件。结果如下:(1)以Bacillus subtilis 168作为宿主克隆表达了来源于Bacillus pumilus ML413的ggt基因。通过SDS-PAGE及酶活力分析,证明GGT在*** 168中成功实现表达并具有催化活性。研究了GGT酶学特性,结果表明,GGT最适催化温度为40°C,最适催化p H为10.0,在一定温度和p H范围内具有较好的酶活性。(2)GGT催化转肽反应常常伴随着NH生成,NH与邻苯二甲醛、三氯乙酸、二甲基亚砜之间会发生显色反应,生成蓝色化合物。通过检测A定量测定GGT催化产物过程中释放的NH浓度,可以表征体系中GGT酶活力的高低。基于此我们建立一种可以高效测定酶活力提高的正向突变菌株的高通量筛选方法。(3)为了进一步提高GGT表达水平,我们通过易错PCR对启动子Hpa II-10区上游的7个碱基进行迭代突变,构建突变体文库。随后,利用建立的高通量筛选方法,获得正向突变启动子EF3Hpa II,可使GGT表达水平较原始菌提高了63%。在此基础上,为获得与启动子EF3Hpa II更加适配的RBS,利用RBS Calculator设计并建立了RBS文库,通过高通量筛选获得人工RBS362。通过组合RBS362与启动子EF3Hpa II共同调控ggt基因的表达,重组菌株GGT的表达量提高至60.25 U·m L,是对照菌的2.02倍。(4)为了进一步提高GGT比酶活,利用易错PCR技术对ggt进行随机突变,构建了突变子文库,结合高通量筛选方法,成功获得比酶活较原始酶提高1.52倍的正向突变体GGT,其比酶活达到29.66 U·mg。通过同源建模、分子对接和分子动力学模拟对突变前后的蛋白结构进行解析,发现463位点氨基酸残基的变化导致其与413位点苏氨酸残基距离“变宽”,便于底物进入与产物释放。这可能是导致突变体GGT比酶活提高的原因。(5)对突变体GGT催化合成茶氨酸的转化条件进行了优化,设置底物浓度为0.2 mol·L L-Gln和2 mol·L乙胺,酶浓度为1.0 U·m L,初始反应温度35℃和p H 10.0,茶氨酸最终产率高达88%。分批补料合成茶氨酸,茶氨酸最终产量达到58.73 g·L,茶氨酸的产率为60%。(6)对突变体GGT催化苦味氨基酸进行了初步研究,并以L-Phe为底物,优化合成γ-Glu-Phe的转化条件。在底物浓度为0.05 mol·LL-Gln和0.2 mol·LL-Phe,酶浓度为1.0 U·m L,初始反应温度35℃和p H 10.0,γ-Glu-Phe最终产率高达94%。

关键词： γ-谷氨酰转肽酶分子优化非理性改造茶氨酸 γ-Glu-Phe

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葡萄糖氧化酶分泌型基因工程菌的构建

葡萄糖氧化酶分泌型基因工程菌的构建

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作者：张琛北京化工大学

学位级别：硕士

葡萄糖氧化酶以氧分子作为电子受体将β-D-葡萄糖转化成为葡萄糖酸,同时产生过氧化氢。微生物生产的葡萄糖氧化酶由于其在化工、医药、食物、饮品、临床化学、生物技术和其他工业中的广泛应用而在近些年收到了极大的关注。近几年葡萄糖... 详细信息

葡萄糖氧化酶以氧分子作为电子受体将β-D-葡萄糖转化成为葡萄糖酸,同时产生过氧化氢。微生物生产的葡萄糖氧化酶由于其在化工、医药、食物、饮品、临床化学、生物技术和其他工业中的广泛应用而在近些年收到了极大的关注。近几年葡萄糖氧化酶在生物传感器上的应用更加大了对其的需求量。在多种工业生产中和作为一种分析酶应用正对生物过程产生越来越多的影响。本论文利用毕赤酵母GS115中成功合成并分泌了黑曲霉Z-25的葡萄糖氧化酶GOD-A,经过发酵最终测定酶活达到17.35U·mL-1。单独在酵母中表达黑曲霉葡萄糖氧化酶具有局限性,单纯依靠甲醇利用快型菌株与多拷贝菌株的筛选无法进一步提高酶活,而理性基因改造中的易错PCR手段等都有研究者进行过研究,得到的结果并不能够达到工业化推进的要求,因此,提高酶活的工作需要引入新的改造手段来进行。于是在利用毕赤酵母GS115表达来自于黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶基因GOD-A的基础上进行酶蛋白与菌株的非理性改造,利用高效率的筛选平台对非理性构建的菌株库进行筛选,最终得到性状良好的菌株。1)利用DNA Shuffling技术对黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行单基因的改造,在酵母体系中进行表达,经过筛选得到***-GS115-pPIC9K-GOD(SFL-A),7d摇瓶的发酵酶活达到32 U·mL-1,3L发酵酶活达到767U?ml/’。2)引入青霉葡萄糖氧化酶基因,进行双基因的嵌合基因库的建立,在酵母体系中进行表达,经过筛选得到***-GS115-pPIC9K-GOD(SFL-A+P),7d酶活最高达到41 ***-1,3L发酵酶活达到927 U?mL-1发酵酶活达到927U?mL-1。3)改造酵母菌株,利用全局转录调控(gTME)手段,对TATA盒结合蛋白(TPB)进行突变,提高菌株的蛋白表达量,得到***-GS115-pPIC9K-GOD(SFL)-13-pPICZaA-Aa-TBP,3d酶活达到24U/ml-1,酶活与对照组18 U?ml/i相比商出33%。采用传代培养的方式进行验证转化子的遗传稳定性。第一代与第五代的发酵酶活分别为21.66 U?mL-1与23.87 U?mL-1表明传代前后菌株巧活能够稳定存在,转化子遗传稳定性良好。采用抗生素梯度鉴定菌株基因拷贝数,对比的结果显示改造之后的基因拷贝数与表达原始基因菌株中的基因拷贝数都为7-12个拷贝,因此判断酶活提髙是由于基因的改变所导致的。针对于热稳定性的改造,得到一株有提窝的菌株#2S菌株,残留酶活2.56%,与出发菌相比(1.85%)提高了38%。

关键词：黑曲霉Z-25 葡萄糖酸葡萄糖氧化酶毕赤酵母非理性改造筛选平台

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