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Serratia marcescens非特异性核酸内切酶的原核表达及其应用

中国生物制品学杂志 2009年第7期22卷 667-670页

作者：张开俊杨莉成都恩多施生物工程技术有限公司成都610041 四川大学生物治疗国家重点实验室成都610041

目的在大肠杆菌中表达Serratia marcescens非特异性核酸内切酶(SMNE),并进行纯化、活性检测及应用。方法合成smne基因,应用PCR技术在基因的5′端引入6个组氨酸标签序列,将其插入分泌表达载体pET-20b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,I... 详细信息

目的在大肠杆菌中表达Serratia marcescens非特异性核酸内切酶(SMNE),并进行纯化、活性检测及应用。方法合成smne基因,应用PCR技术在基因的5′端引入6个组氨酸标签序列,将其插入分泌表达载体pET-20b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。表达产物经镍离子螯合琼脂糖凝胶一步纯化后,检测其活性并计算比活。将纯化的SMNE用于重组腺病毒的制备,对外源性核酸进行降解,并采用Southern blot对外源性DNA残留量进行测定。结果重组表达质粒pET-20b-smne经PCR、双酶切和测序证明构建正确。重组蛋白的表达量为8.0 mg/L,纯化后纯度达95%,比活达1.1×106 U/mg。在重组腺病毒制备过程中使用后,成品中的外源性DNA残留量≤10 ng/5.0×1011 VP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了SMNE,纯化的SMNE活性高,有望应用于重组生物制品制备过程中外源性核酸的去除。

关键词： Serratia marcescens 非特异性核酸内切酶原核表达外源性DNA

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黏质沙雷菌非特异性核酸内切酶通用型定量检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2022年第12期35卷 1495-1499,1505页

作者：毕华朱香卢宁牛林茹杨凌张晓峰周勇梁雅丽中国食品药品检定研究院重组药物室北京100050 山西省生物研究院有限公司山西太原030000 山西集创生物科技有限公司山西太原030000 君研生物科技(山西)有限公司山西太原030000

目的建立黏质沙雷菌(Serratia marcescens)Benzonase核酸内切酶(Serratia marcescens Benzonase endonuclease,SMBE)通用型定量检测方法,并进行验证。方法以突变体SMBE(第110位组氨酸突变为丙氨酸)基因BEHA为模板,PCR法扩增BEHA基因,插入至载体pET-20b(+)中,构建重组表达质粒pET-20b(+)-BEHA,经菌落PCR和测序鉴定。重组表达质粒转化*** BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达后进行一步Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化,纯化产物经15%SDS-PAGE和分光光度计分析,并检测酶活性。用纯化BEHA免疫家兔,以获得的多克隆抗体作为包被抗体,标记HRP的多克隆抗体作为检测抗体,建立SMBE的双抗体夹心ELISA检测法。验证方法的线性范围、准确度、精密性,并确定定量限。采用建立的方法及市售试剂盒分别检测3个厂家生产的SMBE。结果菌落PCR和测序鉴定证明,重组表达质粒pET-20b(+)-BEHA构建正确,第110位氨基酸成功突变为丙氨酸。BEHA的纯度>95%,表达量为3 mg/100 mL,酶活性大幅降低。SMBE标准品在0~20 ng/mL范围内与A_(450)呈良好的线性关系;16、10、0.6 ng/mL的SMBE标准品重复检测3次的偏差分别为-3.06%、-5.40%、3.33%;12和2 ng/mL的SMBE标准品重复10次检测结果CV分别为2.48%和2.91%;定量限为0.2 ng/mL。与市售试剂盒比较,本研究建立的方法对3个厂家生产的SMBE检测结果更接近理论值。结论建立的双抗体夹心ELISA法具有较好的准确度和精密性,该方法可定量检测多种市售SMBE产品,是一种SMBE的通用型定量检测方法。

关键词：黏质沙雷菌非特异性核酸内切酶 Benzonase核酸内切酶双抗体夹心ELISA法

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Ⅱ型限制性内切酶EcoR Ⅰ中非特异性核酸内切酶杂质测试技术研究

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中国测试 2012年第3期38卷 49-51页

作者：谭和平沈兴中唐祥凯王智叶德萍中国测试技术研究院四川成都610021

非特异性核酸内切酶杂质是影响II型限制性内切酶质量的重要因素,该文以EcoR I为例对II型限制性内切酶中非特异性核酸内切酶杂质进行了测试方法研究,以ΦX174 RF I型DNA作为底物,结果显示90U EcoR I中未检出非特异性核酸内切酶杂质,并对... 详细信息

非特异性核酸内切酶杂质是影响II型限制性内切酶质量的重要因素,该文以EcoR I为例对II型限制性内切酶中非特异性核酸内切酶杂质进行了测试方法研究,以ΦX174 RF I型DNA作为底物,结果显示90U EcoR I中未检出非特异性核酸内切酶杂质,并对测试方法进行了方法学考察,显示该方法的重复性、稳定性佳,90U EcoR I可检测到0.1 U的Pst I。

关键词：限制性内切酶非特异性核酸内切酶 EcoR I Pst I

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以WSSV的NSN为靶点的抗病毒药物筛选模型建立及应用

以WSSV的NSN为靶点的抗病毒药物筛选模型建立及应用

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作者：申景雷西北农林科技大学

学位级别：硕士

由白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)引起的对虾白斑综合征(White Spot Disease,WSD)是一种发病快、致死率高、传染性强的病毒性疾病,每年给全球对虾养殖带来严重的经济损失。虾类作为低等无脊椎动物,不具有适应性免疫系... 详细信息

由白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)引起的对虾白斑综合征(White Spot Disease,WSD)是一种发病快、致死率高、传染性强的病毒性疾病,每年给全球对虾养殖带来严重的经济损失。虾类作为低等无脊椎动物,不具有适应性免疫系统,因此,抗病毒药物成为WSD防控的有效手段。随着利巴韦林等一些医用原料药被禁止以来,到目前为止,临床上尚无有效防控WSD的药物,开发抗WSSV的药物成为产业的迫切需求。一直以来,病毒细胞系培养和动物在体模型是抗病毒新药传统筛药的方法。正因为虾类病毒缺乏可增殖细胞系的局限,而依赖动物在体模型筛选往往周期长、成本高、实验动物不稳定等因素,加大了虾类药物创新研究的难度和周期。因此,构建不依赖虾类细胞和动物模型新的高通量药物筛选技术平台,对抗WSSV等虾类病毒新药创新研究具有重要理论意义。随着WSSV蛋白基因组功能的解析,以WSSV复制过程中关键功能酶为靶点进行药物筛选成为新的热点,以酶为靶点的药物筛选具有周期短、靶点明确、节约成本以及可实现大规模筛选等优势。本研究以WSSV复制过程中的关键酶非特异性核酸内切酶(Non-specific endonuclease,NSN)为靶点建立抗WSSV药物筛选模型,并对抑酶活性药物与靶蛋白的相互作用进行初步研究。本研究取得的结果如下:***-NSN的原核表达本研究通过优化白斑综合征病毒非特异性核酸内切酶(WSSV-NSN)碱基序列,合成重组原核表达克隆质粒p ET32a-NSN,经大肠杆菌BL21(DE3)表达纯化后获得了大小约60 k Da的WSSV-NSN重组表达蛋白。***-NSN药物筛选模型的建立首先对WSSV-NSN酶活性进行测定,测得酶比活力为166.7 U/mg,Mg对WSSV-NSN酶活具有较强的激活作用,米氏常数Km值为0.106 mol/L。重组蛋白的浓度为0.11 mg/m L;进一步根据WSSV-NSN酶促反应原理,建立了酶促反应体系,并对WSSV-NSN酶促反应条件进行优化,结果表明,最适酶促反应条件为:反应温度37℃、p H为7、底物浓度10 mmol/L、反应时间20 min、Mg浓度10 mmol/L。建立了以WSSV-NSN为靶点的药物筛选模型。使用统计学指标Z’因子评价筛选模型的稳定性,Z’=0.70,符合药物筛选模型的要求。***-NSN筛药模型的应用优选本实验室药物库中36种抗病毒药物,采用已建立的WSSV-NSN药物筛选模型进行活性评价,结果表明:木犀草素、β-谷甾醇、京尼平苷、肉桂酸和1-羟基吩嗪5种化合物对WSSV-NSN具有一定抑制作用,酶活抑制率分别为96.6%、84.1%、82.3%、80.4%和58.5%。通过圆二色谱(CD)发现:木犀草素、β-谷甾醇都能与WSSV-NSN蛋白发生相互作用引起蛋白二级结构的改变,推测这可能是药物发挥抗病毒作用的关键途径。综上所述,本研究成功建立了有效的以WSSV-NSN为靶点的抗WSSV药物筛选模型,发现木犀草素、β-谷甾醇、京尼平苷、肉桂酸和1-羟基吩嗪五种能有效抑制WSSV-NSN酶活性,具有抗WSSV的潜质,为虾类病毒新药创新研究提供科学基础。

关键词：白斑综合征病毒非特异性核酸内切酶抗病毒药物药物筛选模型

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小麦条锈菌效应蛋白PstNUC1的鉴定及功能初步研究

小麦条锈菌效应蛋白PstNUC1的鉴定及功能初步研究

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中国植物病理学会2021年学术年会

作者：章影田嵩赵晶康振生西北农林科技大学植物保护学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室

小麦条锈菌（Puccinia striiformis ***,Pst）侵染小麦引起的条锈病是一种严重的流行病害,严重威胁了小麦的安全生产。条锈菌在侵染寄主过程中会分泌一系列参与致病的效应蛋白,解析效应蛋白的功能和致病机理对于该病害的防治具有重要意... 详细信息

小麦条锈菌（Puccinia striiformis ***,Pst）侵染小麦引起的条锈病是一种严重的流行病害,严重威胁了小麦的安全生产。条锈菌在侵染寄主过程中会分泌一系列参与致病的效应蛋白,解析效应蛋白的功能和致病机理对于该病害的防治具有重要意义。本研究通过比较分析小麦条锈菌夏孢子侵染小麦和担孢子侵染小檗的转录组,筛选鉴定到1个编码非特异性核酸内切酶的效应蛋白基因PstNUC1,并对该基因进行了克隆和功能分析。PstNUC1在条锈菌夏孢子侵染小麦和担孢子侵染小檗过程中均上调表达。原核表达纯化后的PstNUC1在体外具有非特异性核酸内切酶活性。通过农杆菌介导的烟草瞬时过表达,发现PstNUC1能够诱导烟草细胞坏死,且依赖于其非特异性核酸内切酶活性。通过寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术对该基因的致病功能进行了验证,发现条锈菌在该基因特异性沉默的植株上产孢量和菌落面积减少,生物量降低,表明PstNUC1在条锈菌侵染小麦过程中具有重要致病功能。

关键词：非特异性核酸内切酶 HIGS 小麦条锈菌效应蛋白

来源： cnki会议评论

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