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表面活性剂对华根霉脂肪酶有机相酯合成活性的激活

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高等学校化学学报 2018年第9期39卷 1948-1953页

作者：杨一涵王栋张璋徐岩工业生物技术教育部重点实验室食品安全与营养协同创新中心江南大学生物工程学院无锡214122

利用表面活性剂结合无机盐与华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶(RCL)共冻干,以提高RCL在有机相中的酯合成活性.结果表明,n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)可以显著激活RCL的酯合成活性.DDM激活效果的关键影响因素是DDM与RCL的摩尔比,而非... 详细信息

利用表面活性剂结合无机盐与华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶(RCL)共冻干,以提高RCL在有机相中的酯合成活性.结果表明,n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)可以显著激活RCL的酯合成活性.DDM激活效果的关键影响因素是DDM与RCL的摩尔比,而非DDM浓度;当二者摩尔比大于30时,RCL酯合成活性随着该比值的增大而提高.此外,添加适量无机盐可以进一步强化DDM对脂肪酶酯合成活性的激活效果.利用激活的RCL分别在有机溶剂和无溶剂体系中催化生物香料己酸乙酯和生物柴油油酸乙酯的合成,酯合成效率得到明显提高,表明该方法的有效性和适用性.

关键词：表面活性剂脂肪酶酯合成活性非水相催化无机盐

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华根霉脂肪酶有机相酯合成活性的重塑

高等学校化学学报 2019年第4期40卷 747-754页

作者：张璋王栋王晓雷徐岩工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院酿酒科学与酶技术中心生物工程学院无锡214122 江南大学产业技术研究院宿迁223814 微生物代谢国家重点实验室代谢与发育科学国际合作联合实验室上海交通大学生命科学技术学院上海200240

研究了具有较高酯合成活性的华根霉膜相关脂肪酶及其沉淀酶蛋白的重折叠处理过程,发现膜成分及表面活性剂可能是影响其活性的关键因素.进一步考察了影响异源表达的可溶性华根霉脂肪酶r27RCL酯合成活性重塑的关键因子及作用阶段.研究结... 详细信息

研究了具有较高酯合成活性的华根霉膜相关脂肪酶及其沉淀酶蛋白的重折叠处理过程,发现膜成分及表面活性剂可能是影响其活性的关键因素.进一步考察了影响异源表达的可溶性华根霉脂肪酶r27RCL酯合成活性重塑的关键因子及作用阶段.研究结果表明,表面活性剂对脂肪酶的酯合成活性具有关键影响,直接添加表面活性剂可使酯合成活性显著提高.在7种不同表面活性剂中,两性离子表面活性剂LPC14将r27RCL的酯合成活性提高了5. 75倍.分子动力学模拟结果表明,在有机相反应中,表面活性剂的添加使脂肪酶催化三联体之间的氢键作用力得到加强,从而提高了脂肪酶的有机相酯合成能力.

关键词：表面活性剂脂肪酶非水相催化酯合成活性重塑分子动力学模拟

磷脂酶D制备及催化合成磷脂酰丝氨酸工艺研究

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磷脂酶D制备及催化合成磷脂酰丝氨酸工艺研究

作者：杨治彪西北大学

学位级别：硕士

磷脂酶D是作用于磷脂分子中的磷酰氧键P-O的一类酶,它可以催化两种反应:(1)水解磷脂上的末端磷酸酯键生成磷脂酸和羟基化合物;(2)当有另一种含羟基的化合物存在时,可催化磷脂酰基与其结合,形成新的磷脂,即磷脂酰基转移反应。磷脂酶D广... 详细信息

磷脂酶D是作用于磷脂分子中的磷酰氧键P-O的一类酶,它可以催化两种反应:(1)水解磷脂上的末端磷酸酯键生成磷脂酸和羟基化合物;(2)当有另一种含羟基的化合物存在时,可催化磷脂酰基与其结合,形成新的磷脂,即磷脂酰基转移反应。磷脂酶D广泛存在于各种植物中,在动物和微生物中也有分布。本文以微生物链霉菌作为生产磷脂酶D的菌种,发酵制备磷脂酶D。通过对链霉菌进行自然选育得到了一株磷脂酶D产量较高的链霉菌,以此为出发菌株采用紫外诱变育种方法进行菌种改良,诱变筛选菌株的产磷脂酶D活力提高27%。另外,对发酵制备的酶液进行初步的分离纯化处理,使得发酵液中磷脂酶D的活力提高了2.8倍。通过研究磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸工艺,从实验中得出了基本的反应条件:含酶水相中丝氨酸浓度0.1g/ml,调节pH为5.5;水相与含有大豆磷脂的乙醚相以1:2的体积比混合,在28℃的条件下搅拌反应,磷脂酰丝氨酸的收率达57%。同时,本文还对两相体系中磷脂酶D的催化反应动力学进行了初步研究,确定了在磷脂酶D在水-有机相体系中的反应模型。

关键词：磷脂酶D 磷脂酰基转移反应磷脂酰丝氨酸链霉菌非水相催化

酶法催化合成果糖月桂酸单酯及其分离纯化和性质表征

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酶法催化合成果糖月桂酸单酯及其分离纯化和性质表征

作者：黄友和华南理工大学

学位级别：硕士

糖酯是一类重要的非离子生物表面活性剂,在食品、化妆品、医药、洗涤剂、纤维等工业中有着重要用途。本实验室已建立通过混合溶剂法(叔戊醇+DMSO)催化合成果糖月桂酸单酯体系,由于DMSO的毒性及其难分离性,给后续的分离纯化带来的困难,... 详细信息

糖酯是一类重要的非离子生物表面活性剂,在食品、化妆品、医药、洗涤剂、纤维等工业中有着重要用途。本实验室已建立通过混合溶剂法(叔戊醇+DMSO)催化合成果糖月桂酸单酯体系,由于DMSO的毒性及其难分离性,给后续的分离纯化带来的困难,也限制了产品的应用范围。本实验通过在低毒低沸点有机溶剂叔丁醇中反应催化合成果糖月桂酸单酯,并在其分离纯化后研究其表面性质,为果糖月桂酸单酯的进一步工业化应用奠定基础。本文研究了在有机溶剂叔丁醇中用毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)非水相催化合成果糖月桂酸单酯。在摇瓶水平上分别从冻干保护剂、有机溶剂种类、全细胞催化剂添加量、底物量、底物的配比、温度、水活度及分子筛等因素考察了对合成果糖月桂酸单酯的影响。并在单因素优化的基础上,放大工艺,考察了搅拌速率和低压反应对合成果糖月桂酸单酯的影响。结果表明:0.5%(w/w)的果糖溶液为最佳冻干酶粉保护剂,在5 mL摇瓶体系中,以叔丁醇为反应介质,添加初始水活度为0.06通过凝集素展示在毕赤酵母表面的全细胞催化剂GS115/pKNS-CALB 0.3 g,果糖0.36 g(经0.4 g硅胶粉固定),月桂酸0.8 g,60℃,200 rpm下反应72 h后,果糖月桂酸单酯的产率达到60%。而在200 mL体系中,搅拌转速300 rpm,200 mbar低压搅拌反应下果糖月桂酸单酯产率将近65%。针对酶法合成果糖月桂酸单酯的体系化学组成及其非离子表面活性剂特点,提出了果糖月桂酸单酯分离工艺路线。采用混合溶剂二步萃取法提取体系中的果糖月桂酸单酯。一步萃取得到的最佳工艺条件为:粗产物0.7 g,乙醇0.4 mL,正己烷1 mL,蒸馏水0.2 mL,在常温条件下,果糖月桂酸单酯的萃取率达94%,果糖去除率98%。在一步萃取的基础上进一步研究了混合溶剂二步萃取法分离纯化果糖月桂酸单酯的工艺。结果发现,当再添加正己烷4 mL,乙醇4 mL,蒸馏水1 mL时,达到果糖月桂酸单酯最大萃取率89%,萃取产品纯度为95%。为得到果糖月桂酸单酯纯品以便研究其物理化学性质,采用柱层析梯度洗脱法分离纯化果糖月桂酸单酯,得到99%纯品。分别从亲水-亲油平衡值(HLB值),临界胶束浓度(CMC值),最大吸附量(Γ),最小截面积(A),胶束自由能(ΔG),起泡能力及泡沫稳定性,乳化能力及乳化稳定性考察果糖月桂酸单酯表面活性,结果表明:果糖月桂酸单酯的HLB值为5.8,表明其更适合做油包水(w/o)型乳化剂;其CMC值为2.5×10 mol/L,临界表面张力γCMC为24.2 mN/m,最大吸附量(Γ)为0.7 mol m,最小截面积(A) 23.4×10 m,胶束自由能(ΔG)为-30.5 kJ/mol,说明其有良好的表面活性;其乳化能力和乳化稳定性均与商购蔗糖月桂酸单酯相近,相比之下更快趋于稳定。在研究起泡能力及泡沫稳定性时发现,在低浓度下,果糖月桂酸单酯的起泡能力和泡沫稳定性优于蔗糖月桂酸单酯,在较高浓度下则相反。在实验中发现果糖月桂酸单酯起的气泡较蔗糖月桂酸单酯丰富,细腻,表明果糖月桂酸单酯较蔗糖月桂酸单酯更适合作于低泡表面活性剂。

关键词：果糖月桂酸单酯脂肪酶非水相催化分离纯化表面活性

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固定化糖苷酶在糖苷类化合物合成中的应用

生物工程学报 2021年第12期37卷 4169-4186页

作者：戴家威陈翰驰金晓毛晓灿朱林江陆跃乐陈小龙浙江工业大学生物工程学院浙江杭州310032 浙江工业大学发酵工程研究所浙江杭州310032

糖苷类化合物在医药、食品、表面活性剂和化妆品等领域应用广泛,通过糖苷酶催化糖苷类化合物合成具有原料成本低、反应条件温和等优点。糖苷酶催化过程可分为逆水解反应和转糖苷反应两大类,但反应体系中的水会限制反应的进行,而适当降... 详细信息

糖苷类化合物在医药、食品、表面活性剂和化妆品等领域应用广泛,通过糖苷酶催化糖苷类化合物合成具有原料成本低、反应条件温和等优点。糖苷酶催化过程可分为逆水解反应和转糖苷反应两大类,但反应体系中的水会限制反应的进行,而适当降低体系中的水活度可以有效提高糖苷酶的催化效率。但游离的糖苷酶在低水活度时容易失活,限制了糖苷酶在低水环境下的应用。固定化酶技术通过载体和酶的相互结合能够有效提高酶结构的稳定性,使得糖苷酶能够在低水环境下甚至有机溶剂体系中保持酶活,从而实现糖苷酶在低水活度环境下的应用,提升糖苷合成效率。从糖苷酶催化性质出发,文中归纳了近30年来糖苷酶固定化的相关研究,其中包括单一或综合的固定化技术,以及近些年发展的结合基因工程的固定化技术,为糖苷酶的固定化及糖苷合成提供了可借鉴的思路和方法。

关键词：糖苷类化合物糖苷酶固定化非水相催化

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《应用生物催化》特色教学内容概览

化工时刊 2013年第11期27卷 32-34页

作者：吕英海邹玉红高源张雨晴杨谦牟宗凯山东科技大学化学与环境工程学院山东青岛266590

《应用生物催化》是生物化工专业的核心课程。其研究为化学、医药、食品等领域高附加值产品的生产奠定基础。生物催化的特色教学领域包括非水相体系、手性物质合成、定向进化和极端微生物等方面。应用生物催化核心教学内容的归纳与总结... 详细信息

《应用生物催化》是生物化工专业的核心课程。其研究为化学、医药、食品等领域高附加值产品的生产奠定基础。生物催化的特色教学领域包括非水相体系、手性物质合成、定向进化和极端微生物等方面。应用生物催化核心教学内容的归纳与总结,将有助于学生快速掌握本学科的知识体系,并为生物化工领域的科研人员提供重要参考资料。

关键词：应用生物催化非水相催化手性化合物定向进化极端微生物

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有机溶剂对酵母细胞膜完整性的作用机制研究

食品工业科技 2008年第1期29卷 301-303页

作者：吴培张毅许喜林华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510640 华南理工大学食品科学与工程学院广东广州510640

在非水相催化和涉及有机溶剂环境的微生物技术中,有机溶剂对细胞的毒性使相关的研究和应用受到制约。酵母作为最典型的生物催化剂之一,本文系统阐述了有机溶剂对酵母细胞膜完整性的影响,探讨了有机溶剂对酵母的作用机制。

关键词：非水相催化有机溶剂酵母细胞膜完整性

醛基化大分子强化介孔泡沫硅中青霉素酰化酶和胰蛋白酶的固定化

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南京工业大学学报（自然科学版） 2010年第6期32卷 21-25页

作者：周成姜波绳则翠陈英文沈树宝南京工业大学生物与制药工程学院江苏南京210009

为了提高酶的亚基增强固定化酶的稳定性,在介孔泡沫硅中对固定化酶进行共价修饰.以青霉素酰化酶和胰蛋白酶为目标酶,考察醛基化修饰对固定化酶活力、负载率的影响以及在酸性缓冲溶液、亲水有机体系和离子液体中的催化稳定性,并对固定化... 详细信息

为了提高酶的亚基增强固定化酶的稳定性,在介孔泡沫硅中对固定化酶进行共价修饰.以青霉素酰化酶和胰蛋白酶为目标酶,考察醛基化修饰对固定化酶活力、负载率的影响以及在酸性缓冲溶液、亲水有机体系和离子液体中的催化稳定性,并对固定化酶进行电泳分析.结果表明:醛基化修饰的青霉素酰化酶在酸性缓冲液中6 h保留95%的残余活力,在疏水离子液体中50℃处理10 h保留近80%的残余活力;醛基化胰蛋白酶在20%乙醇中50℃保持活力不变.因此,醛基化修饰能稳定酶的亚基,在创建酶催化的微环境的同时,又能提高酶在极端环境下的稳定性.

关键词：固定化酶化学修饰亚基稳定性非水相催化

基于Western Blot分析的华根霉液态发酵菌体形态与其膜结合脂肪酶生产间规律的研究

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基于Western Blot分析的华根霉液态发酵菌体形态与其膜结合脂肪酶...

作者：周艺博江南大学

学位级别：硕士

脂肪酶能够水解脂肪为甘油和脂肪酸,也可催化非水相酯合成,具有区域选择性、对映选择性和高底物专一性。用于有机相合成的、具有酯化或转酯化功能的脂肪酶的工业化生产对于酶催化合成手性化合物和精细化学品有重要意义。华根霉脂肪酶因... 详细信息

脂肪酶能够水解脂肪为甘油和脂肪酸,也可催化非水相酯合成,具有区域选择性、对映选择性和高底物专一性。用于有机相合成的、具有酯化或转酯化功能的脂肪酶的工业化生产对于酶催化合成手性化合物和精细化学品有重要意义。华根霉脂肪酶因其高酯化合成能力,在生物能源、香精香料等相关产业具有广泛应用潜力。前期研究发现,华根霉摇瓶水平液态发酵过程中,能够随机产生不同形态华根霉菌体,伴随菌体形态的改变,华根霉膜结合脂肪酶合成活性变化显著。本论文针对华根霉菌丝体形态进行液态发酵初步调控,进而利用Western Blot反应初步研究华根霉菌体形态与具有合成活性膜结合脂肪酶生产之间的关系,最后在发酵罐水平进行华根霉发酵初步调控并验证了所产脂肪酶在非水相合成短链脂肪酸酯的应用,摘要如下： (1)华根霉液态发酵摇瓶水平菌体形态初步调控。利用本研究室保藏的华根霉菌株(Rhizopus chinensis CCTCC M201021),在摇瓶水平研究了摇床转速、装液量、挡板条件、接种量、发酵液初始pH及橄榄油添加量等因素对华根霉菌体形态的影响,实现华根霉摇瓶水平不同菌体形态的初步调控。确定影响华根霉菌体形态的关键因素为装液量和挡板条件。块状菌体形成条件：装液量20mL/250 mL发酵摇瓶;摇床转速200 rpm;发酵液初始pH 5.5;接种量5×107spores/mL;培养温度30℃。此条件下,华根霉菌体形态维持光滑块状,脂肪酶合成活性最高。通过调节装液量至40 mL及添加挡板能够分别获得球状菌体及散装菌体。 (2) Western Blot分析华根霉菌体形态及其与合成活性膜结合脂肪酶生产的关系。制备得到华根霉膜结合脂肪酶(sRCL)抗血清并利用Protein A纯化得到sRCL的特异性多克隆抗体。利用sRCL特异性多克隆抗体,通过Western Blot反应,并结合脂肪酶活性分析,检测不同菌体形态下胞内酶、膜结合脂肪酶及胞外酶的产生及分布情况。结果显示,随着华根霉菌体形态不断聚集,华根霉膜结合脂肪酶积累量增加,对应脂肪酶合成活性增加明显。同时,菌体形态的改变显著影响不同区域脂肪酶的分布,即华根霉菌体聚集能够明显抑制脂肪酶由细胞内向胞外分泌。 (3)发酵罐水平华根霉初步发酵调控。华根霉聚集态菌体有利于华根霉合成活性膜结合脂肪酶发酵水平的提高,但在普通机械搅拌发酵罐中华根霉无法形成聚集态菌体,导致无法有效获得具有有机相酯合成活力的膜结合脂肪酶。针对此问题,自行设计支撑网桶装置,使华根霉菌丝体能附着网桶生长,获得聚集态菌体。相对普通机械搅拌发酵罐中发酵产生的散装菌体,聚集态菌体脂肪酶合成酶活提高1倍左右,达到100 U/g。 (4)华根霉脂肪酶非水相催化合成短链脂肪酸酯。在无溶剂反应体系中利用华根霉脂肪酶催化合成短链脂肪酸乙酯,结果表明,其不仅具有良好的催化能力,且与有机相反应体系相比,华根霉脂肪酶在外部脱水-无溶剂反应体系中催化已酸乙酯合成更为有效。

关键词：华根霉膜结合脂肪酶多克隆抗体免疫印迹实验发酵非水相催化