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质谱学报 2019年第4期40卷 314-324,I0001页

作者：胡丹阳蒋碧云王献刘晓慧中南民族大学化学与材料科学学院国家民事委员会分析化学重点实验室湖北武汉430074 复旦大学生物医学研究院上海200032

糖尿病作为最常见的代谢疾病之一,是一种受环境和遗传因素影响的多因素疾病。糖基化可导致蛋白功能多样性,对重大疾病、免疫系统有着深远影响。本实验通过两性离子亲水相互作用色谱(zwitterionic hydrophilic interaction liquid chroma... 详细信息

糖尿病作为最常见的代谢疾病之一,是一种受环境和遗传因素影响的多因素疾病。糖基化可导致蛋白功能多样性,对重大疾病、免疫系统有着深远影响。本实验通过两性离子亲水相互作用色谱(zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography, ZIC-HILIC)富集技术结合微升级高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法,对6例糖尿病人和6例正常人的血清中的蛋白和糖蛋白进行了非标记定量分析,定量了65个差异蛋白和24个差异表达的糖蛋白。通过DAVID软件对这些差异蛋白和差异糖蛋白进行功能富集分析,进一步了解它们的细胞定位、分子功能和生物过程。该研究揭示了糖尿病发病过程中糖蛋白的变化,可为疾病的发病机制和临床诊断提供数据参考。

关键词：糖尿病血清糖蛋白非标定量质谱

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具核梭杆菌具核亚种蛋白质组及其在癌症pH环境下的差异蛋白质组分析

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化学学报 2015年第4期73卷 337-342页

作者：殷薛飞刘晓慧申华莉金红杨芃原复旦大学化学系上海200433 复旦大学生物医学研究院上海200032

利用LC-MS/MS对***的蛋白质表达谱进行了深入研究,共鉴定到1198个蛋白质的表达,占基因组58%的编码基因.通过在p H 6.5(癌症组织p H环境)和p H 7.5(正常组织p H环境)两种条件下***蛋白质表达的定量蛋白质组学分析,发现处于癌症微环境p H... 详细信息

利用LC-MS/MS对***的蛋白质表达谱进行了深入研究,共鉴定到1198个蛋白质的表达,占基因组58%的编码基因.通过在p H 6.5(癌症组织p H环境)和p H 7.5(正常组织p H环境)两种条件下***蛋白质表达的定量蛋白质组学分析,发现处于癌症微环境p H条件下蛋白质表达的变化明显集中于金属离子转运,硫胺素代谢,糖代谢等过程和功能.产丁酸发酵的能量代谢通路中的七个代谢酶在蛋白质组数据中找到,其中有五个在癌症p H条件下显著下调,这五个酶包含了丁酸盐代谢的整个过程,这为结直肠癌患者肠道丁酸盐含量降低提供了新的证明.此外,癌症p H条件下***的丁酸代谢受到抑制,造成产丁酸能力下降,可能是其促进结直肠癌发展在代谢水平上的原因之一.

关键词：具核梭杆菌蛋白质组非标定量 pH环境丁酸代谢

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宫颈腺癌细胞与宫颈鳞癌细胞蛋白表达差异的质谱分析

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山东大学学报（医学版） 2014年第8期52卷 14-21,51页

作者：袁首道王凤琴张娇赵蔚明陈健行山东大学癌症研究中心山东大学医学院山东济南250012

目的通过蛋白组学比较宫颈腺癌细胞与宫颈鳞癌细胞之间的蛋白表达差异,探讨宫颈腺癌预后不良与侵袭/转移率较高的原因。方法通过高效液相色谱与Orbitrap Elite/Velos Pro质谱联用对宫颈腺癌细胞系与宫颈鳞癌细胞系的蛋白组进行鉴定,然... 详细信息

目的通过蛋白组学比较宫颈腺癌细胞与宫颈鳞癌细胞之间的蛋白表达差异,探讨宫颈腺癌预后不良与侵袭/转移率较高的原因。方法通过高效液相色谱与Orbitrap Elite/Velos Pro质谱联用对宫颈腺癌细胞系与宫颈鳞癌细胞系的蛋白组进行鉴定,然后通过生物信息学分析发现两种细胞系之间的差异表达蛋白。结果从两种细胞系中,共鉴定到2 373种高可信度蛋白,其中有787种差异表达蛋白。在腺癌细胞系高表达的蛋白中,有10.8%的蛋白与提高产能代谢相关;在腺癌细胞系低表达的蛋白中,有14.3%的蛋白与调节细胞凋亡相关。此外,细胞骨架蛋白在腺癌细胞系中呈现低表达。结论高产能代谢和低细胞凋亡可能是宫颈腺癌与鳞癌相比预后不良的重要原因,而细胞骨架不稳定性的增加可能导致腺癌更易发生侵袭/转移。

关键词：宫颈癌蛋白组学质谱生物信息学非标定量

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基于质谱技术的糖尿病血清蛋白质/糖蛋白质的定量分析

基于质谱技术的糖尿病血清蛋白质/糖蛋白质的定量分析

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作者：胡丹阳中南民族大学

学位级别：硕士

人体是一个处于动态变化的有机体,每时每刻都在进行着各种反应。人类为了对自身深刻了解,一直以来致力于在基因水平,蛋白质水平以及代谢水平的研究;而从蛋白质水平研究生命系统为研究许多生命的过程提供了重要的见解。蛋白质组学是研究... 详细信息

人体是一个处于动态变化的有机体,每时每刻都在进行着各种反应。人类为了对自身深刻了解,一直以来致力于在基因水平,蛋白质水平以及代谢水平的研究;而从蛋白质水平研究生命系统为研究许多生命的过程提供了重要的见解。蛋白质组学是研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学,是在蛋白质水平上定量、动态、整体地研究生物体,并由此在更深层次上获得对疾病过程、细胞生理和生化过程以及调控网络的广泛而完整的认识。糖蛋白质组学是基于蛋白质组学发展起来的。蛋白质糖基化修饰是最普遍,最重要的蛋白质翻译后修饰之一;其参与许多生物学过程,且已发现异常的蛋白质糖基化修饰与肿瘤,神经退行性疾病等重大疾病的病理过程相关。目前许多临床生物标志物都是糖蛋白。但由于糖蛋白/糖肽在复杂生物样本中丰度较低,且糖肽的离子化效率低,易受到其他非糖肽的抑制,因此在质谱分析前将糖蛋白/糖肽富集出来是糖蛋白分析过程中至关重要的一步。基于质谱的蛋白质组学/糖蛋白质组学在很大程度上改变了生物系统被询问的方式;因为它能够同时测量数千种蛋白质和翻译后修饰,使得研究从蛋白质复合物到人类患者群体的各个生物复杂过程成为可能。本文第二章实验应用Label-free技术对蛋白水平与糖基化水平进行定量,分析研究了6例正常血清和6例糖尿病血清样本,共得到291个非冗余蛋白与181个非冗余糖蛋白,其中疾病组与对照组表达有显著差异的蛋白有65个,糖蛋白24个。KEGG通路分析表明差异糖蛋白显著指向糖尿病,这些糖蛋白广泛参与了补体和凝结级联通路,与糖尿病的发生发展密切相关。在生物医学研究中,与疾病相关能作为生物标志物的一般是中低丰度的蛋白。在第三章研究中,我们运用去高丰度柱除去血清中丰度最高的前14种蛋白质,并通过SDS-PAGE实验对去高丰度效果加以验证。Trypsin/Lys-c联用由于操作相对简单,耗时较少,且很大程度的增加了蛋白检测数量为本实验所使用。在对酶解的肽段进行iTRAQ标记后,为了检测到更多的蛋白质,故对混合肽段离线分馏。质谱数据经过生物信息学分析,共定量到418个蛋白质,其中疾病组与对照组表达有显著差异的蛋白质有14个。通过对14个差异蛋白质进行通路分析,发现在脂肪消化与吸收通路中差异蛋白质主要与脂肪吸收过程与脂肪酸运输有关,从而直接或间接的影响糖尿病的发病过程。总之,我们通过两种不同的定量策略对糖尿病进行定量研究,以系统和全面揭示糖尿病发病过程中蛋白质和糖基化后修饰的变化。这一系列在蛋白质水平和糖基化水平发生差异表达的蛋白质,为研究糖尿病的发生发展过程提供了详实的数据参考。对糖尿病人血清的蛋白的定量研究有利于进一步揭示糖尿病的发病机制。

关键词：蛋白质组学糖蛋白质组学差异蛋白糖尿病非标定量 iTRAQ定量

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重型颅脑伤脑干呼吸中枢（PreBotC）蛋白谱及功能研究

重型颅脑伤脑干呼吸中枢（PreBotC）蛋白谱及功能研究

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作者：李波第二军医大学

学位级别：硕士

随着现代交通工业和高空作业的发展,特别是具有死亡率高、致残率高特点的重型颅脑创伤的发病率逐年升高。重型颅脑创伤具有死亡率高、致残率高的特点,而其导致死亡的一个重要原因就在于脑干生命中枢受损。研究证实,脑干生命中枢存在一... 详细信息

随着现代交通工业和高空作业的发展,特别是具有死亡率高、致残率高特点的重型颅脑创伤的发病率逐年升高。重型颅脑创伤具有死亡率高、致残率高的特点,而其导致死亡的一个重要原因就在于脑干生命中枢受损。研究证实,脑干生命中枢存在一个产生和调节呼吸节律的特殊结构·——pre-Botzinger复合体(pre-Botzinger Complex, preBotC),这为研究脑干抑制特别是呼吸功能不全提供了更加精确的“靶点”。而蛋白组学作为一种系统生物学方法,具有全面、高通量的特点,更适合于描述颅脑创伤后呼吸功能变化这类复杂的机体生物变化。本实验在制备颅脑创伤合并呼吸功能不全动物模型的基础上,应用蛋白组学的方法,以脑干呼吸中枢preBotC为研究对象,应用基于液相色谱——质谱技术的蛋白非标记定量技术建立preBotC差异蛋白谱,并对差异蛋白进行功能分析,进一步探索颅脑创伤合并呼吸功能不全时呼吸中枢preBotC的蛋白质变化,为进一步治疗创伤后呼吸功能不全提供可能的靶标。一、大鼠重型颅脑损伤合并呼吸功能不全模型的建立及脑干呼吸中枢的定位目的：研究大鼠重型颅脑损伤合并呼吸功能不全动物模型的制备方法,探讨脑干呼吸中枢的定位方法,为进一步研究重型颅脑创伤合并呼吸功能不全提供模型基础,为脑干呼吸中枢的取材提供方法学依据。方法：利用液压致伤装置对雄性SD大鼠致伤,制备重型颅脑伤模型(峰压力2.7-2.8 atm),根据伤后2h血气分析筛选合并呼吸功能不全组(简称实验组)。通过延髓舌下神经处定位preBotC解剖平面,再通过其特异性NK1R免疫组化染色,精确定位其在舌下神经平面的具体位置。结果：大鼠致伤后均出现呼吸慢、血压低、心率慢等脑干抑制现象,以呼吸变化最为显著。所有动物伤后均立即出现短暂呼吸暂停,持续时间由1-10分钟不等。动物呼吸机辅助呼吸后,80.0%(36／40)大鼠能恢复自主呼吸但不规则,并最终有33只动物(82.5%)符合血气分析标准纳入重型颅脑伤合并呼吸功能不全组(简称‘实验组’)。结论：本实验成功地建立了大鼠重型颅脑损伤合并呼吸功能不全模型,该模型稳定性好、重复性好,呼吸变化明显,致伤动物通过及时有效的辅助呼吸可存活2小时以上。以舌下神经处为解剖定位标志,成功制备了包含在舌下神经在内的preBotC组织切片,并以NK1R免疫组化的方法精确定位了脑干呼吸中枢preBotC。二、大鼠重型颅脑损伤preBotC的差异蛋白谱研究——“蛋白非标记定量技术” 目的：探讨大鼠重型颅脑损伤后preBotC差异蛋白谱的建立方法,建立大鼠重型颅脑损伤preBotC的差异蛋白谱,为大鼠重型颅脑损伤preBotC的差异蛋白谱的功能分析提供研究基础。方法：提取样品总蛋白后按Bradford法测定总蛋白浓度,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测总蛋白分布,对其进行酶切预处理后采用基于液相色谱-质谱技术的蛋白非标记定量技术(Label-free LC-MS)进行分析,进行数据库检索得到重型颅脑损伤preBotC差异蛋白谱,并对此谱行聚类分析。结果：大鼠重型颅脑伤脑干呼吸中枢差异蛋白谱共74种差异蛋白(差异倍数为2倍,p定量蛋白组学处理和检测方法,该方法稳定性、重现性好,定量精确度高,是一种较好的脑组织深部核团定量蛋白组学检测方法。成功建立了重型颅脑损伤脑干呼吸中枢的差异蛋白谱。三、大鼠重型颅脑伤脑干呼吸中枢差异蛋白谱的功能分析目的：对大鼠重型颅脑伤脑干呼吸中枢差异蛋白谱进行功能分析,为重型颅脑损伤的治疗提供可能的新靶点。方法：采用基因本体学分析(Gene Ontology analysis)对重型颅脑伤preBotC差异蛋白谱从系统学高度进行功能显著性分析,得到差异蛋白谱对应的的显著性变化功能表,同时构建显著性变化功能间的关系网络图(GO Map)。结果：根据大鼠重型颅脑伤preBotC显著性变化功能表和功能关系网络图分析表明,与preBotC74种差异蛋白相对应的显著性变化功能为128种,其中表现为功能上调的为94种,表现为功能下调的34种。同时表明与细胞内蛋白转运,突触小泡转运,神经元分化,腺嘌呤代谢,微管解聚,再生与愈合、组胺摄取与转运,黑色素代谢,退行性蛋白转运,对损伤刺激的反应,能量代谢等九种病理生理变化相关。结论：大鼠重型颅脑伤脑干呼吸中枢(preBotC)差异蛋白谱主要参与的显著性功能为细胞内蛋白转运,突触小泡转运,神经元分化,腺嘌呤代谢,微管解聚,再生与愈合、组胺摄取与转运,黑色素代谢,退行性蛋白转运,对损伤刺激的反应和能量代谢等,其中与呼吸功能直接相关的是黑色素代谢蛋白,微管解聚蛋白和能量代

关键词：脑损伤 preBotC 呼吸功能蛋白质组液相色谱-质谱非标定量

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不同生长因子刺激磷脂酰肌醇-3激酶信号通路的磷酸化蛋白质组学研究

不同生长因子刺激磷脂酰肌醇-3激酶信号通路的磷酸化蛋白质组学研...

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作者：潘秀文复旦大学

学位级别：硕士

生物体中,蛋白质是生命的物质基础,没有蛋白质就没有生命。它的主要功能有运输、催化、调节、免疫、控制等。许多生命现象如物质的运输、能量传递、信号转导等都与蛋白质相关。蛋白质组学通过高通量、高灵敏度的方式对基因组表达的蛋白... 详细信息

生物体中,蛋白质是生命的物质基础,没有蛋白质就没有生命。它的主要功能有运输、催化、调节、免疫、控制等。许多生命现象如物质的运输、能量传递、信号转导等都与蛋白质相关。蛋白质组学通过高通量、高灵敏度的方式对基因组表达的蛋白进行全面的、深入的研究,帮助人们更深刻认识生命以及生命现象。磷酸化是蛋白质组学最重要及最广泛的翻译后修饰之一,它涉及细胞内大部分重要的生命过程,如代谢、物质转运、信号转导、细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤性疾病的发生等生理病理过程都涉及蛋白磷酸化。磷脂酰肌醇-3-激酶信号通路与众多生理、病理过程密切相关,被认为是肿瘤特异性药物的潜在靶点。但是随着研究深入,发现许多问题尚未解决。比如特异性治疗靶点的抑制剂存在潜在的毒性和耐受性,PI3K的变种抵抗激酶抑制剂的作用,致癌靶点在信号通路其他位置发现,其他平行或交叉的信号通路对PI3K抑制剂的耐受性等都有待解决。目前急需发现新的治疗靶点来发展药物,可能会取代PI3K的抑制剂或者加强抑制效果。本论文研究工作涉及化学生物学、细胞生物学和分析化学领域,属于交叉型学科研究。通过将基于质谱的差异蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术相结合,对不同生长因子刺激的磷脂酰肌醇-3-激酶通路进行定量研究,找出差异蛋白与对应的脂肪组学的关系,从而找到PI3K的调节规律等进行联合分析。论文第一章绪论部分,简单综述了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的研究进展以及磷脂酰肌醇-3-激酶信号通路的研究背景。论文第二章主要介绍磷酸化蛋白质组学研究所需要的技术条件,使用标准品和鼠肝对磷酸化肽富集策略的优化。论文第三章主要针对不同生长因子刺激的磷脂酰肌醇-3-激酶信号通路,进行定量研究,运用了多种基于蛋白质组学定量和定性的技术手段。主要有强阳离子交换,非标定量,固定化金属亲和色谱等。本文的主要贡献和创新点为：1)深入了解了实验室已有的实验技术手段,结合本研究课题所需要的知识进行条件的摸索和优化,提出了改进方案,并熟练掌握实验技术和软件处理技术。2)对磷酸化蛋白质组学中鉴定的数据进行生物信息学分析,一共鉴定到了可用来定量的1598条磷酸化肽段,对照组中有250条磷酸化肽,EGF刺激组有1409条磷酸化肽,其中有1340个磷酸化肽对应842个磷酸化蛋白上调。PDGF刺激组有729条磷酸化肽,有566条磷酸化肽对应386个磷酸化蛋白上调。在729条磷酸化肽段中有139条磷酸化肽是在PDGF刺激组单独鉴定到的,对应122个磷酸化蛋白。相比之下,有784条磷酸化肽在EGF刺激组单独鉴定到,对应756个磷酸化蛋白。我们对EGF组和PDGF组单独鉴定到的磷酸化蛋白分别进行序列分析和IPA分析。对EGF刺激组和PDGF刺激组的共有蛋白进行IPA生物信息学分析。

关键词：磷酸化蛋白质组学色谱-质谱联用磷脂酰肌醇-3-激酶非标定量

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