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大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤病理机制及STV保护作用的研究

大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤病理机制及STV保护作用的研究

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作者：陈谨华南理工大学

学位级别：硕士

脑缺血再灌注损伤是一种极为复杂的病理生理过程,涉及到很多种机制,如自由基的生成、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞内钙离子浓度超载等,彼此构成一个互相促进的复杂网络。尽管对脑缺血再灌注损伤机制的研究在不断深入和发展,但是脑缺血... 详细信息

脑缺血再灌注损伤是一种极为复杂的病理生理过程,涉及到很多种机制,如自由基的生成、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞内钙离子浓度超载等,彼此构成一个互相促进的复杂网络。尽管对脑缺血再灌注损伤机制的研究在不断深入和发展,但是脑缺血再灌注损伤各种机制的枢纽点/交汇点尚不明确,有待于更深入地研究。为了探究缺血/再灌注损伤早中晚期所涉及的级联发病机制及探讨STV对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其相关的保护机制。我们运用改良Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型。采用无创伤的激光多普勒血流仪实施实时的检测,分析大鼠造模前后血流变化值,确保模型构建的可靠性。实时监控大鼠的心率、呼吸频率、血氧饱和度及体温等各项生理指标,排除手术之外的其他因素对动物模型构建造成的影响。对各分组大鼠进行行为学评分。应用脑切片氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,最直观的评判脑梗死模型构建的成功与否,同时利用Image J软件来计算梗死面积,表观的衡量STV对脑梗死面积的改善作用。为了探究脑组织蛋白合理有效的分离体系,我们利用不同浓度(10%T,2.6%C或12%T,2.6%C或15%T,2.6%C)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶和4.2%-17.85%T(线性梯度),5%C(交联度)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)为分离系统。利用Western blot蛋白印迹技术检测Thioredoxin 1(Trx1)蛋白、Peroxiredoxin 2(Prx2)蛋白和Heat shock protein 60 kDa(Hsp60)蛋白分别在各组相对应的缺血2 hours/再灌注0 hour/6 hours/22hours/168 hours时间点的表达量,探究STV是否具有神经保护作用及其相关的可能机制。我们成功构建了大鼠脑缺血/再灌注模型,应用脑组织切片的氯化三苯基四氮唑(TTC)染色来评估脑梗死面积,发现STV组跟阳性对照组大鼠的脑梗死面积比手术组减小,同时对于缺血2 hours/再灌注22 hours这个时间点的模型,STV组大鼠比阳性对照大鼠的脑梗死面积大,但是对于缺血2 hours/再灌注168 hours这个时间的模型,STV组大鼠比较阳性对照大鼠的脑梗死面积有所减小。这从一定的程度上说明了,STV对脑缺血组织具有一定的保护作用,且它的长期保护作用更为明显,作用效果强于阳性对照药依达拉奉。我们试验了几种不同浓度(10%T,2.6%C或12%T,2.6%C或15%T,2.6%C)的SDS-PAGE和4.2%-17.85%T(线性梯度),5%C(交联度)SDS-PAGE,最终发现4.2%-17.85%T,5%C的SDS-PAGE对大鼠脑组织蛋白有较好的分离效果。免疫印迹结果表明在缺血2 hours/再灌注0 hour及6 hours时,STV给药组Hsp60表达量减少,说明STV在脑缺血早期能减少脑组织的应激反应。在缺血2 hours/再灌注22 hours,STV组Prx2的表达量明显升高和缺血2 hours/再灌注168 hours模型,Trx1的表达量明显升高,且其表达量也高于阳性对照组。说明Prx2在脑缺血中后期发挥良好的抗氧化作用,防止自由基对脑组织的损害。Trx1在脑缺血后期发挥良好的抗氧化和抗凋亡作用,防止神经元细胞的死亡。在缺血2 hours/再灌注22 hours时,STV组的Prx2的表达量高于同一时期Trx1的表达,说明在缺血2 hours/再灌注22 hours时,STV主要是通过上调Prx2的表达来发挥抗氧化作用。在缺血2 hours/再灌注168 hours时,STV主要是通过上调Trx1的表达来发挥抗凋亡作用。实验结果表明,在脑缺血再灌注损伤的不同时期,STV启动不同的信号通路来保护脑组织。除了上述的工作外,我们还进行了以下的工作。我们结合非变性微型二维凝胶电泳,网格凝胶切取以及定量液相色谱串联质谱(获取数据非依赖型模式,MS),用来构建数字化非变性蛋白质谱图,同时,为了改进此研究模式,我们采用了新的质谱串联模式,采用了增强离子淌度分离的数据非依赖模式串联质谱(HDMS模式),并将此模式运用到人类血浆蛋白质分析的工作中。即人类血浆样品经过非变性微型二维凝胶电泳分离,将得到的低密度脂蛋白(LDL)所在的长方形区域(18 mm×4.8 mm)切割成72块方形胶粒并将胶粒经过一系列处理后进行定量的液相色谱串联质谱分析(LC-MS/MS)。所得的结果显示,与MS相比,HDMS表现出更好的分析性能,鉴定所得蛋白质种类数目提高了约50%,并且每种蛋白质在更多的胶粒中被检测到,即对每种蛋白质得到了更全面的谱图。运用LC-

关键词：脑缺血再灌注损伤大脑中动脉闭塞/再灌注模型 STV Heat shock protein 60 kDa(Hsp60) Peroxiredoxin 2(Prx2) Thioredoxin 1(Trx1) 非变性微型凝胶二维电泳网格凝胶切取定量液相色谱串联质谱非变性蛋白质谱图低密度脂蛋白

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基于非变性微型2DE-网格凝胶切取—定量LC-MS/MS蛋白质相互作用组学方法的建立及人类血浆蛋白质的分析

基于非变性微型2DE-网格凝胶切取—定量LC-MS/MS蛋白质相互作用组...

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作者：步淑杰华南理工大学

学位级别：硕士

蛋白质之间相互作用的研究对于理解蛋白质的功能及细胞过程的机理至关重要,但目前常用的蛋白组学策略在蛋白质相互作用的大规模分析上均有显著不足。本工作中,我们首次建立了基于“非变性微型凝胶二维电泳?网格凝胶切取?定量纳升级液相... 详细信息

蛋白质之间相互作用的研究对于理解蛋白质的功能及细胞过程的机理至关重要,但目前常用的蛋白组学策略在蛋白质相互作用的大规模分析上均有显著不足。本工作中,我们首次建立了基于“非变性微型凝胶二维电泳?网格凝胶切取?定量纳升级液相色谱串联质谱联用”的全新蛋白质相互作用组学策略,并成功地应用于人类血浆高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)的研究。HDL是一种具有高多态性的血浆蛋白,其成员具有不同的蛋白和脂类组成,在人血浆蛋白的非变性2DE谱图上表现为两个维度的广泛分布(p I 4.6-5.3,Mw 70-500 k Da,文献中以免疫化学染色(immunochemistry)[1]及基质辅助激光解吸电离质谱肽指纹图谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry Peptide mass fingerprinting,MALDI-MS PMF)[2]验证HDL具有两个维度的广泛分布。因此我们选择了该蛋白组作为新组学策略研究中的模型体系。具体来说,人血浆蛋白经非变性微型2DE分离,将HDL所在区域(5 mm?18 mm)均匀地切割为5列、18行,共90个1 mm?1 mm的方形胶粒,每一个胶粒中的蛋白均经胶内酶解、肽段提取、定量标准品添加等处理,所得肽段样品进行定量液相色谱串联质谱分析(LC-MS/MS,非标定量),获得所含蛋白的种类及含量信息。采用网格凝胶切取的意义在于(i)保证切取区域内的蛋白全部投入分析,克服传统的选点切取对于染色较淡区域的忽视;(ii)标准化LC-MS/MS样品处理中的诸条件;(iii)能够根据LC-MS/MS定量结果重构出非变性蛋白在凝胶上的分布。在90个方形胶粒中,共检测到154种蛋白(角蛋白已剔除),每种蛋白都有其在所有网格中的含量信息。我们编写了Excel Visual Basic(VB)宏程序绘制了相应的网格(5列?18行),并针对每种蛋白将其在各方格中的含量以不同浓淡的颜色填入,如此,重构了每种蛋白在凝胶网格切取区域的含量分布谱图,我们将其定义为非变性蛋白谱图(Native protein map),共得到154个蛋白质非变性谱图。通过对154个蛋白质非变性谱图的比较,发现载脂蛋白A-I(Apolipoprotein A-I,Apo A-I)的非变性谱图与之前以免疫化学染色[1]测定的HDL分布区域相吻合,这与Apo A-I是HDL的主要蛋白成分相符。将Apo A-I与其它153种蛋白的非变性谱图相比较,发现11种蛋白的分布与Apo A-I的主要分布区域(p I 4.8-5.1,Mw 80-200 k Da)具有很高的相似性,文献查询证实这11种蛋白都有多篇文献报道为HDL的组成蛋白。对低丰度蛋白的非变性谱图的分析进一步发现有20种蛋白质分布在Apo A-I的主要分布区域,其中7种分泌蛋白(共9种分泌蛋白)有文献报道与HDL存在相互作用。本论文中所建立的方法的原创性在于首次对非变性2DE凝胶采用网格切取以利于后接定量LC-MS/MS,通过重构非变性蛋白含量谱图、谱图比较,从而分析蛋白质间相互作用。首次实现人血浆HDL成员或相关蛋白在非变性凝胶上分布的可视化,对研究高血脂等与HDL分布及代谢密切相关的疾病的致病机制和药物研发工作具有重要意义。目前,该方法已成功应用于真核细胞蛋白质组大规模相互作用预测的研究[3]。最后,我们讨论了非变性微型2DE分离的Sprague Dawley(SD)大鼠血浆蛋白(CBB染色)?所有胶点选点切取?LC-MS/MS的分析结果,该工作首次报道SD大鼠血浆蛋白在非变性2DE凝胶上的分布及种类(2-DE mapping),对于以SD大鼠为实验动物的各项研究具有参考意义。

关键词：非变性微型凝胶二维电泳网格凝胶切取定量液相色谱串联质谱蛋白质相互作用组学非变性血浆蛋白谱图

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