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青蛤Ⅰ型溶菌酶在毕赤酵母中的重组DNA表达

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水产科学 2022年第5期41卷 836-843页

作者：冯付霭赵震陶妍谢晶钱韻芳上海海洋大学食品学院上海201306 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306

Ⅰ型溶菌酶是无脊椎动物免疫系统中一种富含半胱氨酸的重要蛋白质免疫因子,具有良好的抗病原微生物功能。通过反转录PCR自青蛤闭壳肌中克隆到Ⅰ型溶菌酶(CslyⅠ)基因,以pPⅠCZαA为表达载体、毕赤酵母X-33为工程菌,构建重组毕赤酵母菌株... 详细信息

Ⅰ型溶菌酶是无脊椎动物免疫系统中一种富含半胱氨酸的重要蛋白质免疫因子,具有良好的抗病原微生物功能。通过反转录PCR自青蛤闭壳肌中克隆到Ⅰ型溶菌酶(CslyⅠ)基因,以pPⅠCZαA为表达载体、毕赤酵母X-33为工程菌,构建重组毕赤酵母菌株X-33/pPⅠCZαA-CslyⅠ,经高质量浓度博莱霉素培养基筛选获得高拷贝重组菌株。该菌株在28℃、250r/min条件下,经1%甲醇诱导表达72h后获得蛋白质类表达产物。Western blot和MALDⅠ-TOF/TOF质谱分析表明,该表达产物为预期的重组青蛤Ⅰ型溶菌酶;进一步的抑菌试验证明,该重组青蛤Ⅰ型溶菌酶具有抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌的活性,并且显示良好的热稳定性。本研究可为无脊椎动物来源Ⅰ型溶菌酶的制备提供基于重组毕赤酵母的生物合成技术。

关键词：青蛤 Ⅰ型溶菌酶重组毕赤酵母菌株蛋白质表达抑菌活性

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青蛤染色体制备及核型分析

水产学报 2020年第5期44卷 735-741页

作者：段海宝陈义华董志国张敏葛红星魏敏周丽青符翔超孙泽鹏江苏海洋大学江苏省海洋生物资源与环境重点实验室江苏海洋大学江苏省海洋生物技术重点实验室上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室

以青蛤成体鳃组织和性成熟的雌、雄青蛤性腺为材料,采用常规制片方法,分别制备青蛤二倍体染色体和单倍体染色体,统计染色体数目。结果显示,青蛤二倍体与单倍体染色体数目分别为2n=38和n=19;核型分析发现,青蛤核型组成为11m+6sm+2st,NF=... 详细信息

以青蛤成体鳃组织和性成熟的雌、雄青蛤性腺为材料,采用常规制片方法,分别制备青蛤二倍体染色体和单倍体染色体,统计染色体数目。结果显示,青蛤二倍体与单倍体染色体数目分别为2n=38和n=19;核型分析发现,青蛤核型组成为11m+6sm+2st,NF=76,未发现性染色体和随体染色体。本研究以青蛤成熟性腺为制备材料,成功制备单倍体染色体,与青蛤二倍体染色体互相印证,弥补了以往研究的不足,进一步丰富了对青蛤染色体数目及核型组成的认知。同时,也为青蛤染色体水平全基因组测序组装提供更加科学的基础资料。

关键词：青蛤染色体性染色体单倍体核型分析

青蛤紫色壳色形成原因初探及相关基因克隆表达分析

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青蛤紫色壳色形成原因初探及相关基因克隆表达分析

作者：吴雨晨江苏海洋大学

学位级别：硕士

贝类壳色常呈现出多态性,壳色可以作为优良性状的标记色,用于贝类良种选育研究。目前关于青蛤的研究报道,主要集中于其生物学特性、形态结构、生殖生理以及苗种培育等方面,然而对于青蛤壳色形成的原因、分子机制及青蛤紫、白壳个体间生... 详细信息

贝类壳色常呈现出多态性,壳色可以作为优良性状的标记色,用于贝类良种选育研究。目前关于青蛤的研究报道,主要集中于其生物学特性、形态结构、生殖生理以及苗种培育等方面,然而对于青蛤壳色形成的原因、分子机制及青蛤紫、白壳个体间生长及营养差异方面的研究尚未见报道。因此,本研究先对青蛤紫壳成因进行初步探究,了解到色素主要存在于紫壳珍珠层中且类胡萝卜素可能是紫壳中色素的主要组成部分,紫壳中总类胡萝卜素含量在外套膜外缘选择性沉积,青蛤紫壳个体与类胡萝卜素的含量存在一定正向连锁关系;通过对青蛤紫、白壳个体之间生长指标和营养成分的测定,探究壳色性状与其生长和营养之间的关系,了解到紫壳和白壳个体间在生长和营养上均存在一定差异,且紫壳性状与其生长和营养存在一定正向关联关系;利用RACE技术克隆并鉴定青蛤壳色相关基因的全长c DNA序列,并利用q RT-PCR技术分析基因表达的组织分布,了解到相关基因可能在外套膜中类胡萝卜素选择性运输发挥重要作用。本研究的具体结果如下:(1)为了探究青蛤紫壳的形成原因,本研究通过体视镜测定青蛤壳中紫色色素的分布、使用电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定金属元素含量、使用拉曼光谱仪获得青蛤壳中色素的拉曼光谱、通过提取青蛤不同组织中的总类胡萝卜素算出类胡萝卜素在各组织中的分布及探索壳中色素的物理和化学性质一系列实验。结果显示,与白色贝壳相比,紫色贝壳中交替出现紫色和白色区域,紫色色素主要存在于珍珠层与贝壳棱柱层交界处的珍珠层中;紫色和白色贝壳中的铁和锰含量存在一定差异,但差异无统计学意义;类胡萝卜素的强峰(1510-1513、1125-1128、1014-1016、1297-1299 cm)出现在紫壳的紫色部分的拉曼光谱中,而在紫壳的紫色部分和白壳的白色部分中未观察到类胡萝卜素峰,类胡萝卜素可能是壳中紫色色素的主要成分;紫壳中的总类胡萝卜素含量高于白壳,紫壳青蛤外套膜外缘的总类胡萝卜素含量约为外套膜内缘的4倍,是白壳青蛤外套膜外缘的3倍,但差异无统计学意义(P>0.05),类胡萝卜素在外套膜外缘、外套膜内缘、水管、腹足和性腺中大量沉积,紫壳青蛤外套膜外缘和壳中番茄红素、叶黄素、玉米黄质和β-胡萝卜素的含量均显著高于白壳青蛤(P青蛤外套膜和壳的外缘有选择性运输。(2)为了探究青蛤壳色性状与其生长和营养成分之间的关系,本研究对青蛤不同壳色个体的生长指标及营养组分进行了测定分析。结果显示,青蛤紫壳个体(整体)的湿重、壳长、水管和鳃组织湿重占比显著高于白壳个体(P青蛤紫壳个体(整体)的壳宽和外套膜组织湿重占比极显著高于白壳个体(P青蛤紫壳个体可食部分的粗脂肪和粗蛋白含量极显著高于白壳个体(P青蛤良种选育提供理论依据。(3)本研究利用RACE技术成功克隆并鉴定了青蛤壳色相关基因低密度脂蛋白受体基因(ldlr,low density lipoprotein receptor)的全长c DNA序列,并利用q RT-PCR技术分析了ldlr基因表达的组织分布。结果表明,ldlr基因的全长c DNA序列共961 bp,包含666 bp开放阅读框,编码221个氨基酸,系统进化树结果表明青蛤与牡蛎有着相对密切的进化关系,说明其进化地位最为相近。q RT-PCR结果显示,ldlr基因编码的m RNA在紫壳青蛤的外套膜外缘高度表达。研究结果表明,类胡萝卜素可能在紫壳青蛤外套膜中选择性转运,ldlr基因可能在外套膜中类胡萝卜素的选择性运输中发挥重要作用,但还需要进一步的功能研究,将有助于阐明青蛤壳颜色的形成机制。该论文有图14幅,表8个,参考文献161篇。

关键词：青蛤壳色营养类胡萝卜素 ldlr

青蛤不同地理野生群体形态学、环境适应性及营养品质分析

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青蛤不同地理野生群体形态学、环境适应性及营养品质分析

作者：夏青江苏海洋大学

学位级别：硕士

青蛤(Cyclina Sinensis)是我国重要的经济性贝类之一,隶属于瓣鳃纲(Lamellibranchia)、异齿亚纲(Heterodonta)、帘蛤目(Venerida)、帘蛤科(Veneridae),青蛤亚科(Cyclininae),青蛤属(Cyclina),伴随近年来过度捕捞、养殖效果欠佳、近亲繁殖等问题,青蛤种质资源退化日益严重。本文尝试对国内青蛤野生群体在多方面的差异性进行探索,聚焦于对青蛤不同野生群体的形态学、环境适应性及营养品质进行分析比较,不仅能为青蛤不同群体遗传学提供理论研究基础,也有助于为青蛤种质资源评估与保护、良种移植和大规模生产培育提供参考。本文主要研究结果如下:1、青蛤不同地理野生群体数量性状的相关性与通径分析对采集到的中国沿海地区11个青蛤野生群体各性状进行相关性分析,了解到各群体不同性状之间的相关程度存在差异,说明不同群体在形态上并非一致。结果显示所有群体的壳长、壳高、壳宽、壳顶到壳前端的距离、壳顶到壳后端的距离、外韧带末端到壳前端的距离、外韧带末端到腹缘底的距离等7个形态性状都与活体质量具有极显著相关性(P青蛤各群体对活体质量产生主要影响的形态性状,发现对青蛤不同群体活体质量影响最大的形态指标有所不同,并通过主要形态性状对活体质量的直接及间接作用,建立了不同青蛤群体以活体质量为因变量的最优多元回归方程。2、5个青蛤野生群体环境适应性的比较对5个青蛤野生群体(丹东、天津、东营、盐城、温州)的环境适应性的研究结果表明,不同群体在质量增长指标上未见显著差异(P>0.05),但在壳长、壳高、壳宽相关增长率上存在差异显著(P青蛤不同群体对活体质量产生主要影响的形态性状并不相同。比较5个群体的存活率发现,盐城群体存活率最高(65.86±0.57%),温州群体的存活率最低(29.90±2.40%),且显著低于其他4个群体(P青蛤的杂交育种工作提供了极大的便利性。研究同时发现性腺指数较高的群体在肥满度方面表现较好,说明青蛤的肥满度与性腺指数存在极大相关性。从肥满度以及不同部位的糖原含量来看,青蛤丹东群体的能量储存能力要优于其它群体,这也意味着丹东群体可能在后续秋冬季代谢表现上会更具优势。与此同时,结果显示雄性青蛤体内糖原含量的整体水平要高于雌性青蛤,因此推测雄性青蛤的能量储存能力要优于雌性青蛤,对环境具有更强的适应能力。3、5个青蛤野生群体营养成分分析及品质评价青蛤不同地理野生群体的脂肪酸和氨基酸种类一致,但在含量上有所差别。青蛤不同野生群体软体部分均富含饱和脂肪酸,主要以C16:0为主;多不饱和脂肪酸中EPA和DHA的含量较高,说明不同来源地的青蛤均具有较高的营养价值。不同群体都具有氨基酸总含量高的营养特性,且鲜味氨基酸占比较大,说明青蛤的风味极佳。结果显示,移植前后青蛤不同群体软体部分的EAA/TAA和NEAA/TAA的比值都符合FAO/WHO理想蛋白模式评价标准,说明青蛤各群体在移植前后都是优质蛋白来源。另外,通过比较发现1年的同环境放养并不能完全消除青蛤群体间的营养差异,而且部分群体在多个营养指标含量上较移植前存在显著降低(P青蛤营养品质。本篇论文含图7幅,表41张,参考文献124篇。

关键词：青蛤形态学通径分析环境适应性生长性能营养品质

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青蛤的种质、养殖及其开发利用研究进展

水产学报 2021年第12期45卷 2083-2098页

作者：董志国段海宝郑汉丰葛红星魏敏柳梅梅陈义华李晓英江苏海洋大学江苏省海洋生物资源与环境重点实验室江苏海洋大学江苏省海洋生物技术协同创新中心江苏海洋大学江苏省海洋生物技术重点实验室江苏省生态环境评估中心中国水产科学研究院东海水产研究所

青蛤是沿海地区重要的海产经济贝类,广泛分布于中国沿海的滩涂及河口地区,在中国已开展了广泛的养殖和浅海增殖。本文从青蛤的基因组学、系统分类、种群多样性、遗传发育、苗种繁育、养殖生态、生理生化和营养及药用价值方面,系统地综... 详细信息

青蛤是沿海地区重要的海产经济贝类,广泛分布于中国沿海的滩涂及河口地区,在中国已开展了广泛的养殖和浅海增殖。本文从青蛤的基因组学、系统分类、种群多样性、遗传发育、苗种繁育、养殖生态、生理生化和营养及药用价值方面,系统地综述了青蛤的种质资源发掘、评价与利用研究进展,并就野生资源的保护与评估、育苗技术与良种选育、绿色高效养殖与碳汇渔业以及营养价值与深加工等方面提出了未来的发展方向。

关键词：青蛤种质资源繁殖发育养殖生态

青蛤性腺发育及性别相关基因dmrt1和foxl2的表达研究

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青蛤性腺发育及性别相关基因dmrt1和foxl2的表达研究

作者：廖晓婷江苏海洋大学

学位级别：硕士

性别差异是有性生殖生物的基本特征,而性别决定及性别分化是生物个体发育过程中的主要过程。在水产动物中,两性的生长速度不同,因此理解和控制水产动物的性别发育意义重大。青蛤(Cyclina sinensis)是我国重要的养殖经济贝类之一,目前有... 详细信息

性别差异是有性生殖生物的基本特征,而性别决定及性别分化是生物个体发育过程中的主要过程。在水产动物中,两性的生长速度不同,因此理解和控制水产动物的性别发育意义重大。青蛤(Cyclina sinensis)是我国重要的养殖经济贝类之一,目前有关其性别决定及分化的研究较少。本研究以青蛤为实验对象,首先探究了不同月龄青蛤的生长规律,并通过组织学技术观察不同月龄的青蛤内脏团以探究其性别分化发生的最早时间;随后运用RNA-seq对成熟青蛤增殖期的精巢和卵巢进行转录组测序,通过高质量序列拼接组装及基因注释,深入挖掘与性别决定和分化、性腺发育等相关差异表达基因(DEGs)以及调控通路;最后通过对青蛤性别决定和分化相关基因dmrt1(double-sex and Mab-3 related transcription factor)和foxl2(forkhead transcription factor gene 2)的序列进行生物信息学分析,并探究其在青蛤不同胚胎发育阶段、不同组织、不同性腺发育阶段及不同月龄幼贝中的表达差异以初步解析其基因功能。本研究有助于进一步了解青蛤性别决定和分化的分子机制,为后续青蛤遗传选育提供参考资料。具体结果如下:(1)青蛤幼贝生长及性腺组织学研究青蛤幼贝首周年体重、壳重、软体重、壳长、壳高和壳宽六项生长指标增长同步,且呈阶段性增长,增长速率均呈先减小后增加的的趋势,在5-7月龄几乎停止生长。因此推测青蛤幼贝的生长呈季节性变化,且其生长受温度和饵料变化的影响。通过对青蛤3-12月龄去除斧足和肝胰腺的内脏团进行连续的组织学观察,发现在幼贝的内脏团中,三月龄时即可观察到精原细胞、精细胞等雄性特征,而在幼贝达到六月龄时才可观察到卵原细胞等雌性特征,这表明青蛤雄性性别分化时间早于雌性。(2)青蛤雌雄性腺的转录组学分析转录组结果显示总共获得raw reads条数为279,513,030(其中卵巢140,937,740,精巢138,575,290),经数据质控后,共获得clean reads条数为277,871,788(其中卵巢140,109,554,精巢137,762,234),Q30碱基百分比在93.1%以上。使用DESeq2软件,共获得1,440条精巢与卵巢的差异表达基因。对DEGs进行GO和KEGG富集分析,发现DEGs显著富集的term包括细胞周期过程(cell cycle process)、生殖过程(reproductive process)、精子发生(spermatogenesis)等,主要富集的通路有细胞循环(Cell cycle pathway,map04110)、c AMP信号通路(c AMP signaling pathway,map04024)、Fox O信号通路(Fox O signaling pathway,map04068)等。而c AMP信号通路对于生物的性别决定的调控中具有重要作用。通过筛选获得了dmrt1、hpgds、ctsd、smad4、sox30、cdk2、foxl2和gata4基因跟性别决定和分化相关的DEGs以及ccnb3、cdc20和vn跟性腺发育相关的DEGs。(3)青蛤性别相关基因dmrt1和foxl2基因的表达分析采用RACE技术克隆青蛤dmrt1和foxl2基因的cDNA全长。Csdmrt1的cDNA全长为1,611 bp,开放阅读框序列1,137 bp,共编码378个氨基酸;Csfoxl2的ORF区为1,245 bp,编码414个氨基酸,存在保守的FH结构域。分析Csdmrt1和Csfoxl2的时空表达,发现Csdmrt1的表达呈现性别二态性,在精巢内显著高表达,推测该基因参与雄性青蛤的性别决定和分化;两个基因在性腺不同发育时期的表达水平与性腺发育呈正相关,可见Csdmrt1与Csfoxl2基因在青蛤性腺的发育与维持中发挥重要作用,且可能参与生殖细胞的形成;在所有组织中,Csfoxl2基因在斧足的表达量最高,推测Csfoxl2在青蛤神经干细胞的发育及组织的分化和形成中发挥着重要的作用;分析青蛤不同月龄内脏团的Log(dmrt1/foxl2)值的动态变化,发现dmrt1基因在3-5月龄相对于foxl2表达量较高,从6月龄起,foxl2相对于dmrt1开始高表达,与第二章中获得的雌雄青蛤生理上性别分化的时间点相吻合,推测dmrt1和foxl2的相对表达变化能够导致青蛤分化为不同性别。该论文有图20幅,表9个,参考文献153篇。

关键词：青蛤月龄性腺发育转录组 dmrt1 foxl2

青蛤I型溶菌酶在毕赤酵母中的重组DNA表达

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水产科学 2021年

作者：冯付霭赵震陶妍谢晶钱韻芳上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心

I型溶菌酶是无脊椎动物免疫系统中一种富含半胱氨酸的重要蛋白质免疫因子，具有良好的抗病原微生物功能。通过RT-PCR从青蛤闭壳肌中克隆到I型溶菌酶（CslyI）基因；以pPICZαA为表达载体、毕赤酵母X-33为工程菌，构建重组毕赤酵母菌株X-... 详细信息

I型溶菌酶是无脊椎动物免疫系统中一种富含半胱氨酸的重要蛋白质免疫因子，具有良好的抗病原微生物功能。通过RT-PCR从青蛤闭壳肌中克隆到I型溶菌酶（CslyI）基因；以pPICZαA为表达载体、毕赤酵母X-33为工程菌，构建重组毕赤酵母菌株X-33/pPICZαA-CslyI，经高质量浓度博莱霉素培养基筛选获得高拷贝重组菌株。该菌株在28 ℃、250 r/min条件下，经1%甲醇诱导表达72 h后获得蛋白质类表达产物。Western blot和MALDI-TOF/TOF质谱分析表明，该表达产物为预期的重组青蛤I型溶菌酶；进一步的抑菌试验证明该重组青蛤I型溶菌酶具有抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌的活性，并且显示良好的热稳定性。本研究为无脊椎动物来源I型溶菌酶的制备提供了基于重组毕赤酵母的生物合成技术。

关键词：青蛤 I型溶菌酶重组毕赤酵母菌株蛋白质表达抑菌活性

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青蛤不同壳色个体间生长及营养差异分析

水产学报 2021年

作者：魏敏吴雨晨陈东张明月王亦我仉佳文仇攀宋杰董志国江苏海洋大学江苏省海洋生物资源与生态环境重点实验室/江苏省海洋生物技术重点实验室江苏海洋大学江苏省海洋生物产业技术协同创新中心

贝类壳色常呈现出多态性，壳色可以作为优良性状的标记色，用于贝类良种选育研究。为了探究青蛤壳色性状与其生长和营养成分之间的关系，本研究对青蛤不同壳色个体的生长指标及营养组分进行了测定分析。结果显示，青蛤紫壳个体（整体）... 详细信息

贝类壳色常呈现出多态性，壳色可以作为优良性状的标记色，用于贝类良种选育研究。为了探究青蛤壳色性状与其生长和营养成分之间的关系，本研究对青蛤不同壳色个体的生长指标及营养组分进行了测定分析。结果显示，青蛤紫壳个体（整体）的湿重、壳长、水管和鳃组织湿重占比显著高于白壳个体（P＜0.05），青蛤紫壳个体（整体）的壳宽和外套膜组织湿重占比极显著高于白壳个体（P＜0.01）。青蛤紫壳个体可食部分的粗脂肪和粗蛋白含量极显著高于白壳个体（P＜0.01）。紫/白壳个体的必需氨基酸与总氨基酸比值分别为37.46%和37.02%，且紫壳个体显著高于白壳个体（P＜0.05）；必需氨基酸与非必需氨基酸比值分别为67.72%和66.60%，且紫壳个体显著高于白壳个体（P＜0.05），表明紫壳个体氨基酸平衡效果优于白壳个体，且均属于优质蛋白。紫/白壳个体的单不饱和脂肪酸主要以棕榈酸为主，分别占可食部分脂肪酸总量的9.97%和9.85%，多不饱和脂肪酸主要以EPA和DHA为主，其中EPA分别占脂肪酸总量的6.64%和6.54%，DHA分别占脂肪酸总量的8.00%和8.51%。研究表明，紫/白壳个体间在生长和营养上均存在一定差异，且紫壳性状与其生长和营养存在一定正向关联关系，为利用紫壳性状作为遗传标记进行青蛤良种选育提供理论依据。

关键词：青蛤壳色生长营养

青蛤(Cyclina sinensis)TRAF6基因克隆及其在PolyI:C胁迫下的免疫应答

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海洋与湖沼 2016年第5期47卷 1040-1046页

作者：高玮玮潘宝平闫春财天津市河西区职工大学天津300203 天津师范大学生命科学学院天津市动植物抗性重点实验室天津300387

对青蛤(Cyclina sinensis)转录组文库筛选并克隆得到青蛤TRAF6(Cs TRAF6)基因的c DNA序列,其开放阅读框为2337bp,编码778个氨基酸,分子量为86.59k Da。Cs TRAF6蛋白包含RING型锌指结构,两个TRAF型锌指结构,coiled-coil结构域以及MATH结... 详细信息

对青蛤(Cyclina sinensis)转录组文库筛选并克隆得到青蛤TRAF6(Cs TRAF6)基因的c DNA序列,其开放阅读框为2337bp,编码778个氨基酸,分子量为86.59k Da。Cs TRAF6蛋白包含RING型锌指结构,两个TRAF型锌指结构,coiled-coil结构域以及MATH结构域。经生物信息学及分子系统学分析表明Cs TRAF6属于TRAF6家族的一员。利用实时荧光定量PCR方法检测了Cs TRAF6基因在青蛤各个组织以及在Poly I:C侵染下在血淋巴中的时序性表达情况。结果表明,Cs TRAF6基因在青蛤血淋巴、闭壳肌、鳃、性腺、外套膜和肝脏中普遍表达,其中在血淋巴中的表达水平最高。在Poly I:C刺激后的3h,青蛤血淋巴中Cs TRAF6的表达量迅速升高,在6h达到最大值,说明青蛤的Cs TRAF6基因参与了病毒类似物侵染下的免疫应答反应。

关键词：青蛤 CsTRAF6 Poly I:C 荧光定量PCR

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