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青岛文昌鱼血清淀粉样蛋白P成分基因的克隆、表达与进化分析

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青岛文昌鱼血清淀粉样蛋白P成分基因的克隆、表达与进化分析

作者：王玉璎鲁东大学

学位级别：硕士

血清淀粉样蛋白P成分(Serum amyloid P component,SAP)是一种短正五聚蛋白,它普遍存在于脊椎动物和无脊椎动物中,具有多种功能,包括参与免疫调节及淀粉样蛋白沉积等,在临床医学方面也具有重要的应用价值。头索动物文昌鱼(Branchiostoma... 详细信息

血清淀粉样蛋白P成分(Serum amyloid P component,SAP)是一种短正五聚蛋白,它普遍存在于脊椎动物和无脊椎动物中,具有多种功能,包括参与免疫调节及淀粉样蛋白沉积等,在临床医学方面也具有重要的应用价值。头索动物文昌鱼(Branchiostoma)是无脊椎和脊椎动物之间的一类过渡型动物,在过去的200多年里,文昌鱼已经成为研究脊椎动物起源与进化的典型模式动物,在比较免疫学、发育生物学和细胞遗传学等领域的研究中发挥了关键性作用。本论文以青岛文昌鱼(B.tsingtauense)为实验对象,进行了SAP基因的分子克隆、原核表达、原位杂交和实时定量探索,并利用生物信息学软件对其进行进化分析,研究结果如下:1、运用RT-PCR和RACE技术,克隆出青岛文昌鱼SAP基因c DNA全长序列,该序列含有1438个碱基,其中5’非编码端有200个碱基,3’非编码端有293个碱基,开放阅读框有945个碱基,编码314个氨基酸,预测该蛋白的理论分子质量是35.6 k Da,其理论等电点为5.92,原子总量为4988,分子式为CHNOS,具有分子间盐桥、Ca结合位点和正五聚蛋白结构域。应用生物信息学软件进行了一系列的分析,结果显示青岛文昌鱼SAP基因的进化地位处于无脊椎和脊椎动物之间,并与无脊椎动物的亲缘关系较近。2、利用DNA重组技术,成功构建了p ET28a(+)-SAP的重组质粒,经IPTG诱导后表达的蛋白,通过SDS-PAGE电泳和WB实验验证是SAP目的蛋白。这为后续研究青岛文昌鱼SAP蛋白是否可以体外表达及SAP蛋白纯化和结构及功能分析奠定了基础。3、采用原位杂交技术研究了SAP基因在青岛文昌鱼体内的组织表达情况。实验结果显示,SAP基因在青岛文昌鱼成体的腹褶内淋巴窦、卵巢、肌膜、鳃上沟和肝盲囊中表达,并且在不同的组织中的表达量有明显差异,其中腹褶内淋巴窦中的表达量最高,卵巢、肌膜、鳃上沟和肝盲囊的表达量相对较少,基于SAP基因在某些免疫器官或组织表达,推测SAP可能参与了青岛文昌鱼的免疫反应。4、利用q PCR技术分析了青岛文昌鱼SAP基因在不同的刺激物中的表达量的变化。在Cu浓度为0.01 mg/L时,SAP基因表达量达到峰值,随着Cu浓度的逐渐增加,SAP基因的表达量逐步降低。在副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和LPS的胁迫下,均是在第6 h时,SAP基因表达量达到峰值,随后表达量逐渐下降。结果显示,在不同刺激物的胁迫下SAP基因的表达量也有一定的差异,并且随不同刺激物胁迫时间的延长,SAP基因的表达量呈现的表达趋势具有一致性,确定SAP参与了青岛文昌鱼体内的免疫反应,初步推测SAP在青岛文昌鱼抗毒害和先天性免疫过程中具有一定的防御作用,并且提示SAP可作为青岛文昌鱼感染早期的一种生物标志物。

关键词：青岛文昌鱼血清淀粉样蛋白P成分克隆表达进化分析

青岛文昌鱼单胺氧化酶基因的克隆、表达与进化分析

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青岛文昌鱼单胺氧化酶基因的克隆、表达与进化分析

作者：丁烁鲁东大学

学位级别：硕士

单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)是一种以二聚体的形式存在于线粒体膜表面的黄素蛋白,它能够催化多种单胺类神经递质和神经调节剂以及外源单胺活性,根据其对底物和抑制剂的灵敏度,分为MAO-A和MAO-B两类,且有很大概率从一个祖先进化... 详细信息

单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)是一种以二聚体的形式存在于线粒体膜表面的黄素蛋白,它能够催化多种单胺类神经递质和神经调节剂以及外源单胺活性,根据其对底物和抑制剂的灵敏度,分为MAO-A和MAO-B两类,且有很大概率从一个祖先进化而来。本文对MAO的分类与分布、基因、动力学机制、化学机制、功能及抑制剂等方面介绍了MAO的研究进展,并对MAO未来的研究方向进行了讨论。头索动物文昌鱼(Branchiostoma)作为无脊椎动物与脊椎动物之间的一种过渡物种,已经成为研究脊椎动物起源与进化的重要模式动物,它在细胞遗传学、发育生物学、比较免疫学等生命科学领域研究中发挥了关键作用,并做出了重要贡献。1.本文采用PCR与RACE技术首次克隆得到青岛文昌鱼单胺氧化酶基因cDNA完整序列。其cDNA序列全长2170bp,起始密码子ATG位于149-151位核苷酸,终止密码子是TAA位于1748-1750位核苷酸,5’非编码端长度为148bp,3’非编码端长度为420bp,ORF长为1602bp。2.通过生物信息学技术对青岛文昌鱼单胺氧化酶基因进行分析,MAO基因编码的蛋白质序列长度为533aa,利用生信软件预测其理论分子质量为58383.54Da,理论等电点是8.19,属于膜蛋白,膜结合位点在氨基酸序列C末端,总体上属于亲水性蛋白。单胺氧化酶属于胺氧化酶家族,一个含黄素胺氧化还原酶结构域,一个赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶结构域,一个单胺氧化酶结构域。通过构建系统进化树显示青岛文昌鱼单胺氧化酶基因进化地位处于脊椎动物和无脊椎动物之间,与无脊椎动物同源性更高。3.利用基因重组技术构建MAO-pET-28b(+)原核表达载体,经IPTG诱导后表达出目的蛋白,并通过Western blot方法对该蛋白进行初步鉴定,结果显示目的蛋白为青岛文昌鱼MAO基因的表达蛋白。4.通过原位杂交技术和荧光定量PCR对青岛文昌鱼单胺氧化酶基因进行组织表达差异研究。原位杂交结果显示在青岛文昌鱼的表皮、脊索及围鳃腔上皮中均观察到MAO表达,在脊索中活性最高,说明其可能参与调控文昌鱼的定向运动和诱导细胞分化。利用荧光定量PCR技术分析Cu、金黄色葡萄球菌及副溶血性弧菌对青岛文昌鱼MAO基因表达的影响,发现Cu的浓度与青岛文昌鱼体内的MAO基因表达量呈正相关,在Cu浓度为0.05mg/L时相对表达量达到峰值。在受到金黄色葡萄球菌影响的第4h和受到副溶血性弧菌影响的第2h、6h和10h青岛文昌鱼MAO基因相对表达量上升,同时与PBS对照组相比差异显著。MAO基因受金黄色葡萄球菌影响的第4h相对表达量达到峰值,MAO基因受副溶血性弧菌影响的第6h相对表达量达到峰值。说明受不同细菌及不同时间的影响,MAO参与调控的反应速度与反应程度有所不同,MAO基因参与了机体的免疫作用。

关键词：青岛文昌鱼单胺氧化酶基因克隆进化分析组织表达

青岛文昌鱼过氧化氢酶基因的克隆及生物信息学分析

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基因组学与应用生物学 2020年第2期39卷 514-523页

作者：于德玲王昌留袁牧段菁菁胡岳鲁东大学生命科学学院烟台264025

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,是生物体内抗氧化酶体系的重要成员,因此本研究旨在克隆文昌鱼CAT基因并对其进行生物信息学分析。本研究以青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauen... 详细信息

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,是生物体内抗氧化酶体系的重要成员,因此本研究旨在克隆文昌鱼CAT基因并对其进行生物信息学分析。本研究以青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)为材料,用RACE技术首次克隆了其CAT全长cDNA的基因序列,命名为AmphiCAT(GenBank登录号:KU058636);该序列总长为2640 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1533 bp,编码510个氨基酸,含有一个长为19个氨基酸序列的潜在活性位点和一个长为9个氨基酸序列的血红素配体信号,总分子量在线预测约为57.85 kD;经生物软件分析确定该蛋白质无信号肽序列,预测该蛋白质为非分泌性蛋白,属于单功能CAT的clade3分支;该基因的分子进化树表明青岛文昌鱼CAT同软体动物的亲缘关系较近。

关键词：过氧化氢酶基因克隆序列分析青岛文昌鱼

基于MaxEnt的渤、黄海青岛文昌鱼潜在栖息地分析

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海洋通报 2024年

作者：朱茵霖冯建龙赵亮天津科技大学海洋与环境学院

青岛文昌鱼（Branchiostoma belcherii tsingtaneuse）作为一种古老的脊索动物，是无脊椎动物向脊椎动物进化的过渡类型，具有广泛的研究价值。近年来因海洋环境的变化而日渐稀少，现已成为国家二级野生保护动物。本研究运用最大熵模型... 详细信息

青岛文昌鱼（Branchiostoma belcherii tsingtaneuse）作为一种古老的脊索动物，是无脊椎动物向脊椎动物进化的过渡类型，具有广泛的研究价值。近年来因海洋环境的变化而日渐稀少，现已成为国家二级野生保护动物。本研究运用最大熵模型（Maximum Entropy Model，MaxEnt），结合高分辨率渤、黄海ROMS-CoSiNE物理—生态耦合模型数值模拟结果，对青岛文昌鱼春季、夏季和秋季的潜在栖息地分布，以及影响青岛文昌鱼潜在栖息地分布的重要环境因子进行了系统分析。研究结果表明：3个季节的MaxEnt模型受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic Curve，ROC）评价结果的平均曲线下面积（Area Under the Curve，AUC）高达0.988，模型适用于不同季节的青岛文昌鱼潜在栖息地分布研究。青岛文昌鱼的潜在适生区主要分布在河北秦皇岛、山东半岛南部和黄海西部沿岸海域，模型结果与青岛文昌鱼实际出现记录高度一致。通过环境变量对模型贡献率排序和刀切法结果得出，春季到秋季3个季节中影响青岛文昌鱼潜在栖息地分布的重要环境因子分别是磷酸盐、水深和硅藻。磷酸盐随季节的浓度变化以及磷酸盐与硅藻生长之间的密切关系或许是造成青岛文昌鱼适宜栖息地分布变化的主要原因。

关键词：青岛文昌鱼最大熵模型潜在栖息地渤海黄海 ROMS-CoSiNE模型

青岛文昌鱼碱性磷酸酶基因的克隆、表达与生物信息学分析

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青岛文昌鱼碱性磷酸酶基因的克隆、表达与生物信息学分析

作者：王文军鲁东大学

学位级别：硕士

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,E.C.3.***.3.1,ALP)是一种磷酸单酯水解酶,它普遍存在于除一些高等植物外的原核及真核生物中。作为现代生物化学中不可或缺的代表性调节剂,ALP涉及到生化过程的多个方面,包括代谢、信号转导、分子运输、... 详细信息

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,E.C.3.***.3.1,ALP)是一种磷酸单酯水解酶,它普遍存在于除一些高等植物外的原核及真核生物中。作为现代生物化学中不可或缺的代表性调节剂,ALP涉及到生化过程的多个方面,包括代谢、信号转导、分子运输、遗传信息的表达及免疫防御等生命活动。它在临床医学、食品检测、土壤与环境监测、生物学基础研究等多个领域中应用广泛。头索动物文昌鱼(Branchiostoma)作为无脊椎与脊椎动物间的过渡物种,已经成为研究脊椎动物起源及进化的重要模式动物,在细胞遗传学、发育生物学、比较免疫学等生命科学领域研究中发挥了关键作用并做出了重要贡献。基于文昌鱼在生物进化上具有特殊地位,本论文以青岛文昌鱼为实验对象,进行了ALP基因的克隆、表达与生物信息学分析,探索了ALP基因的结构组成及功能并分析其表达情况。初步研究结果如下:1、本研究运用RACE技术首次克隆获得青岛文昌鱼ALP基因c DNA全长序列。该基因序列全长1916bp,其中5’UTR为9bp,3’UTR为152bp,ORF区域长1755bp,对应编码584个氨基酸,预测理论分子质量大小是62841.89 Da,理论等电点是5.29,在第24～25个氨基酸位置存在信号肽。预测该基因蛋白不具有跨膜结构,总体上属于疏水性蛋白,该蛋白具有催化活性位点、金属结合位点、底物结合位点、同源二聚体结构域。系统进化树显示青岛文昌鱼ALP基因的进化地位处于脊椎动物分支与无脊椎动物分支之间,并更接近脊椎动物。2、运用DNA重组技术构建p ET-28a(+)-ALP原核表达载体,经IPTG诱导后表达出目的蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot方法初步检测并验证了该目的蛋白即为青岛文昌鱼ALP基因的表达蛋白。3、组化染色结果显示ALP主要分布于青岛文昌鱼的背鳍腔内皮、肌膜、腹褶表皮、中肠腔及卵巢中,且中肠腔ALP表达活性最强,由此推测其与中肠腔作为重要的消化与吸收场所有关。4、运用荧光定量PCR分析不同刺激物对青岛文昌鱼ALP基因相对表达量的影响。在不同浓度的Cu刺激下,随着Cu浓度升高,该基因表达量先上调后下调,且在0.03mg/L的Cu浓度下相对表达量最大。在金黄色葡萄球菌刺激后第2h和10h时,以及在副溶血性弧菌刺激后第4h和12h时均与对照组(PBS)相比出现明显表达差异。

关键词：青岛文昌鱼碱性磷酸酶基因克隆基因表达生物信息学

青岛文昌鱼铜锌超氧化物歧化酶基因特征与遗传进化分析

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基因组学与应用生物学 2018年第1期37卷 272-279页

作者：袁牧王昌留段菁菁胡岳黄莹陈静马欢鲁东大学生命科学学院

RT-PCR和RACE技术首次克隆了青岛文昌鱼超氧化物歧化酶基因的全长cDNA序列1 285 bp,该基因开放阅读框全长468 bp,编码155个氨基酸,有7个可与铜锌离子结合的位点,预测分子量大约为15 718.32 Da,理论等电点为5.60,编码的蛋白质不存在亚细... 详细信息

RT-PCR和RACE技术首次克隆了青岛文昌鱼超氧化物歧化酶基因的全长cDNA序列1 285 bp,该基因开放阅读框全长468 bp,编码155个氨基酸,有7个可与铜锌离子结合的位点,预测分子量大约为15 718.32 Da,理论等电点为5.60,编码的蛋白质不存在亚细胞定位的信号肽和跨膜结构域,属于胞内铜锌超氧化物歧化酶。系统进化分析表明文昌鱼的胞内铜锌超氧化物歧化酶位于脊椎动物大分支和无脊椎动物大分支的中间,并且更偏向于脊椎动物。

关键词：青岛文昌鱼超氧化物歧化酶基因克隆序列分析系统进化树

青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因的克隆、表达与生物信息学分析

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青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因的克隆、表达与生物信息学分析

作者：段菁菁鲁东大学

学位级别：硕士

文昌鱼是国家二级保护动物,在进化上位于脊椎动物与无脊椎动物之间,是研究进化发育的过渡模型。本文对青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因进行了克隆,获得了其髓过氧化物酶基因序列,为研究青岛文昌鱼的进化发育、免疫等提供了分子基础。髓过氧... 详细信息

文昌鱼是国家二级保护动物,在进化上位于脊椎动物与无脊椎动物之间,是研究进化发育的过渡模型。本文对青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因进行了克隆,获得了其髓过氧化物酶基因序列,为研究青岛文昌鱼的进化发育、免疫等提供了分子基础。髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)是过氧化物酶家族的重要成员之一,主要存在于嗜中性粒细胞和单核细胞中,是含血红素辅基的血红素蛋白酶,是反应中性粒细胞和巨噬细胞活化的特异性指标。髓过氧化物酶存在于动物体内或其分泌物中,植物中暂时没有发现。目前关于髓过氧化物酶的报道较多集中于人类髓过氧化物酶的研究。髓过氧化物酶氧化反应产生的活性氧和氯胺(NH2Cl)在机体防御中起重要作用;但同时生成的活性氧在产生超过机体清除时就会对正常组织如内皮细胞、脂质、DNA产生损伤,导致多种疾病,如动脉粥样硬化、白血病、肾炎、多发性炎、肿瘤等。本文采用RT-PCR和RACE技术首次克隆了青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因的全长cDNA序列是3403bp,5’端非编码区长379bp,3’端非编码区长642bp,开放阅读框全长2379bp,编码793个氨基酸。预测其理论分子质量为87074.09Da,理论等电点为4.78,预测该蛋白属于分泌蛋白,存在信号肽,具有1个跨膜区,且绝大部分蛋白位于膜外。由此可以推测青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因编码的蛋白在细胞质中合成,经过跨膜转运,分泌到胞外发挥作用。系统进化分析表明文昌鱼的髓过氧化物酶基因位于脊椎动物大分支和无脊椎动物大分支的中间,并且更偏向于脊椎动物。原位杂交实验与DAB染色实验表明,髓过氧化物酶基因在文昌鱼的表皮、肝盲囊、脊髓中均有表达,在肝盲囊和脊髓周围等表达较高,推测原因是表皮和肝盲囊是构成文昌鱼免疫系统的重要部位,而髓过氧化物酶是免疫反应中重要的酶类之一;至于脊髓高表达的原因有待进一步研究。

关键词：青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因克隆基因表达生物信息学分析

青岛文昌鱼室内养殖群体和野生群体性腺发育的对比观察

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热带海洋学报 2013年第4期32卷 78-83页

作者：马得友尤锋文爱韵谭训刚徐永立张立敬张培军中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室山东青岛266071 中国科学院大学北京100049 中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物疾病控制与分子病理学实验室山东青岛266071

本文采用组织学方法对比观察了青岛文昌鱼Branchiostoma japonicum室内养殖群体和野生群体在2009年11月底,及2010年1月中、3月底、5月底及7月初的性腺发育情况。结果表明,室内和野生群体的全长和体重在群体和个体水平上都没有显著差异(P... 详细信息

本文采用组织学方法对比观察了青岛文昌鱼Branchiostoma japonicum室内养殖群体和野生群体在2009年11月底,及2010年1月中、3月底、5月底及7月初的性腺发育情况。结果表明,室内和野生群体的全长和体重在群体和个体水平上都没有显著差异(P>0.05),2010年7月初两个群体的体重有明显的增加。室内雌文昌鱼卵巢在2010年5月全部处于Ⅳ期,此时野生文昌鱼的卵巢仍有50%处于Ⅲ期;室内雄文昌鱼精巢的发育在2010年3月快于野生文昌鱼,其余月份室内和野生雌雄文昌鱼的性腺发育基本一致。这可能与2010年3月外海海水温度远低于室内海水温度有关。较外海环境更稳定的室内环境对文昌鱼的长期培育是否有利也是值得深入探究的。

关键词：青岛文昌鱼室内养殖群体野生群体性腺发育组织学

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青岛文昌鱼过氧化氢酶基因的克隆与表达研究

青岛文昌鱼过氧化氢酶基因的克隆与表达研究

作者：于德玲鲁东大学

学位级别：硕士

HO是生物体内经常产生的活性氧之一。过量的HO几乎对细胞的所有成分都是有害的,因此快速有效的去除HO对于需氧的原核生物和真核生物都是至关重要的。过氧化氢酶(catalase)是一种广泛存在于各种生物内的活性酶。早期对过氧化氢酶的研究... 详细信息

HO是生物体内经常产生的活性氧之一。过量的HO几乎对细胞的所有成分都是有害的,因此快速有效的去除HO对于需氧的原核生物和真核生物都是至关重要的。过氧化氢酶(catalase)是一种广泛存在于各种生物内的活性酶。早期对过氧化氢酶的研究主要集中在该酶的化学特性。随着分子生物学及基因工程的迅速发展,越来越多的学者用分子手段来研究过氧化氢酶及其基因的结构与功能。文昌鱼隶属于脊索动物门(Chordata)头索动物亚门(Cephalochordata),是重要的研究脊椎动物起源与进化的海洋模式生物。文昌鱼作为一种分类地位十分特殊的物种,近几十年来随着人类对其栖息地的破坏及海域环境的污染,其资源量急剧下降,成为濒危物种。过氧化氢酶可以通过清除动物体内氧自由基延缓衰老,并提高动物机体的免疫力。本文对文昌鱼的过氧化氢酶基因进行了克隆,分析了其基因序列和蛋白质序列,并与其他物种进行了同源性比对,构建了系统发育树,运用生物信息学方法推测了蛋白质的一些性质,同时利用原位杂交技术和实时定量PCR技术对文昌鱼过氧化氢酶的功能做了初步研究。这为深入研究文昌鱼过氧化氢酶基因的结构与功能奠定了基础,也为文昌鱼的抗病及病害预防提供了一定的理论基础。本文采用RACE技术首次克隆了文昌鱼过氧化氢酶基因的全长cDNA序列,命名为AmphiCAT(GenBank登陆号:KU058636)。该基因全长为2640bp,其中3’非翻译区(untranslated region,UTR)长度为981bp,5’非翻译区为126bp,开放阅读框(ORF)为1533bp,编码510个氨基酸,预测分子量大约为57.85kDa。文昌鱼过氧化氢酶基因cDNA推导的氨基酸序列包含一个长19个氨基酸的潜在活性位点序列HFNRERIPERVVHAKGHGA以及一个长9个氨基酸的血红素配体信号序列RLFSYSDTH。生物软件分析发现该蛋白质序列无信号肽,推测其不属于分泌蛋白;结构预测表明文昌鱼CAT蛋白为单功能的过氧化氢酶的clade3分支;系统进化分析表明文昌鱼与软体动物的亲缘关系较近,且分类地位与传统分类基本一致。以获得的cDNA序列为模板设计引物,用文昌鱼的基因组为模板进行了PCR反应,将获得的序列拼接后获得了一段5000bp左右的序列片段。将过氧化氢酶基因序列在NCBI中进行blast比对,推测其可能含有4个内含子。原位杂交实验表明,过氧化氢酶基因在文昌鱼的肝盲囊、肠道、皮肤、性腺以及脊索中均有表达。在肝盲囊、肠道、皮肤等的高表达可能与这些器官直接接触重金属或致病菌等外界环境有关。实时定量PCR结果显示过氧化氢酶的表达受重金属的影响,当铬离子浓度为10mg/L时该酶的表达量会明显升高,这可能与该酶中的巯基和重金属发生作用有关。这也反应了该酶与文昌鱼的免疫有一定的关联。虽本文对文昌鱼的过氧化氢酶进行了研究,但是其在免疫方面的具体作用机制并不是很清楚,尚有待进一步的探索。

关键词：青岛文昌鱼过氧化氢酶基因克隆基因表达