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一株产褐藻胶裂解酶的需钠弧菌筛选及酶解产物分析

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微生物学通报 2022年第2期49卷 421-436页

作者：孟青江波周力铖陈静静张涛江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122

[背景]褐藻胶裂解酶种类丰富、降解机制多样,是高效环保降解褐藻胶、制备褐藻寡糖的工具酶,成为褐藻植物高值化开发利用的研究热点。[目的]从海泥中筛选获得褐藻胶裂解酶高效产酶菌株,确定菌株发酵产酶最优条件,鉴定和分析酶降解产物,... 详细信息

[背景]褐藻胶裂解酶种类丰富、降解机制多样,是高效环保降解褐藻胶、制备褐藻寡糖的工具酶,成为褐藻植物高值化开发利用的研究热点。[目的]从海泥中筛选获得褐藻胶裂解酶高效产酶菌株,确定菌株发酵产酶最优条件,鉴定和分析酶降解产物,进而解析该酶的降解特性。[方法]以褐藻胶为唯一碳源,从海带养殖场附近海泥中筛选菌株,通过形态学观察、生理生化实验和16S rRNA基因序列比对进行菌种鉴定。优化发酵培养基并利用筛选菌株进行发酵产酶。利用红外和阴离子交换色谱分析不同程度酶解产物以确定该酶的降解偏好,利用薄层色谱和液相色谱-质谱鉴定酶降解的终产物。[结果]筛选鉴定得到一株产褐藻胶裂解酶的需钠弧菌(Vibrio natriegens)SK42.001,最优产酶培养基为海藻酸钠8.0 g/L、(NH_(4))2SO_(4)8.0 g/L、NaCl 30.0 g/L、MgSO_(4)·7H_(2)O 5.0 mmol/L和K_(2)HPO_(4)·2H_(2)O 10.0 mmol/L,发酵酶活为(5.20±0.14)U/mL。菌株所产酶偏好于降解褐藻胶中的古罗糖醛酸片段,并且终产物聚合度较为单一,主要为褐藻三糖。[结论]筛选到褐藻胶裂解酶高效产酶菌株Vibrio natriegens SK42.001,该菌株所产酶具有古罗糖醛酸降解偏好性且可特异性生产褐藻三糖,具有进一步开发用于大规模制备褐藻胶裂解酶或褐藻寡糖生物制品的潜力。

关键词：褐藻胶褐藻寡糖褐藻胶裂解酶需钠弧菌降解特性

基于需钠弧菌的乙偶姻发酵生产与1，3-丁二醇合成关键酶表达

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基于需钠弧菌的乙偶姻发酵生产与1，3-丁二醇合成关键酶表达

作者：张永佳山东大学

学位级别：硕士

需钠弧菌（Vibrio natriegens）是一种革兰氏阴性非致病海洋细菌,具备快速的生长、高效的底物摄取及强大的蛋白表达能力,除可作为代谢工程改造的底盘细胞外,还可作为表达宿主进行外源蛋白的高效表达,在生物技术领域具有良好的应用前景... 详细信息

需钠弧菌（Vibrio natriegens）是一种革兰氏阴性非致病海洋细菌,具备快速的生长、高效的底物摄取及强大的蛋白表达能力,除可作为代谢工程改造的底盘细胞外,还可作为表达宿主进行外源蛋白的高效表达,在生物技术领域具有良好的应用前景。乙偶姻是一种重要的C4平台化合物,广泛应用于食品、化工、化妆品等行业。1,3-丁二醇作为非天然的C4二醇,被广泛应用于多种工业领域。本论文旨在建立V.natriegens的高效基因敲除方法;通过对V.natriegens进行代谢工程改造,利用V.natriegens的耐盐特性使用海水代替淡水非灭菌发酵生产乙偶姻;基于V.natriegens蛋白表达宿主Vmax-1,异源表达和纯化1,3-丁二醇人工合成途径中的7个酶,验证以葡萄糖为底物,通过体外合成生物体系生产1,3-丁二醇的可行性。论文第二章在课题组内建立了 V.natriegens模式菌株ATCC 14048的基因敲除技术。首先使用基于双亲杂交和自杀质粒的同源重组以及基于自然转化和FLP/FRT的位点特异性重组技术（又被称为自然转化多重基因编辑技术,MuGENT）对V.natriegens中dns基因进行了敲除。发现使用同源臂长度为1500 bp的线性DNA片段,MuGENT技术的第一轮筛选阳性率为85%,后续抗性标记消除效率为100%,相比基于双亲杂交和自杀质粒的同源重组技术具有显著优势,但会在基因组上留下FRT位点。为解决该问题,建立了基于自然转化和归巢内切酶I-SceI的V.natriegens中基因无痕敲除技术。使用同源臂长度为1500 bp的线性DNA片段,第一轮筛选的阳性率为91%,第二轮筛选的阳性率为30%,但阳性转化子均为实现无痕基因敲除的菌株。该方法可实现V.natriegens的快速基因编辑,且不会在V.natriegens基因组上留下标记,为V.natriegens的代谢工程改造提供了良好的技术支持。基于海水的非灭菌发酵可以简化发酵工艺流程,节约能源消耗与淡水资源。论文第三章基于V.natriegens的耐盐特性,探索了使用海水代替淡水非灭菌发酵生产乙偶姻的可行性。首先在V.natriegens ATCC 14048中表达来自阴沟肠杆菌SDM的乙偶姻合成基因获得工程菌株VN-1,确定菌株VN-1可在海水配制的VN基本培养基中通过非灭菌发酵生产乙偶姻,乙偶姻的产量及得率与用蒸馏水配制的VN基本培养基经灭菌后发酵基本一致;敲除菌株VN-1中琥珀酸及乳酸合成基因获得工程菌株VN-4,通过外源添加乙酸钠促进乙偶姻合成基因表达,菌株VN-4可在15 h内,经补料分批发酵消耗74 g/L葡萄糖,积累乙偶姻29.10 g/L,乙偶姻得率为0.39 g/g,生产效率达1.94 g/L/h。V.natriegens具有作为蛋白表达宿主的潜力,论文第四章设计了一条基于葡萄糖,且辅因子内部循环再生的1,3-丁二醇人工合成途径,分析了 V.natriegens作为宿主表达纯化1,3-丁二醇合成相关蛋白的可行性。将7个1,3-丁二醇合成相关蛋白的表达质粒引入商业化V.natriegens表达菌株Vmax-1中,确定了各蛋白表达纯化的最适条件。对基于V.natriegens Vmax-1和常规蛋白表达宿主大肠杆菌（Escherichia coli）BL21表达纯化的葡萄糖脱氢酶GDH、二羟基羧酸脱水酶PuDHT、醛醇氧化酶ALDO活力进行测定,发现以Vmax-1为宿主获得的重组蛋白活力略高于以E.coli BL21为宿主获得的重组蛋白。最后使用7个通过Vmax-1表达纯化的蛋白耦合商品化过氧化氢酶,初步实现了基于葡萄糖的1,3-丁二醇体外生物合成。

关键词：需钠弧菌基因敲除非灭菌发酵蛋白表达乙偶姻 1,3-丁二醇

需钠弧菌(Vibrio natriegens)合成聚羟基丁酸的研究

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生物工程学报 2002年第5期18卷 614-618页

作者：刘双江中国科学院微生物研究所北京100080

研究结果表明 ,V .natriegens可以利用葡萄糖、果糖、以及糖蜜为碳源合成聚羟基丁酸 [Poly(3HB) ];当以糖蜜为碳源时 ,积累的Poly(3HB)达到细胞干重的 2 8.4%。实验结果还表明 ,Poly(3HB)的积累滞后于细胞生长 ,在培养前加入过量的碳源 ... 详细信息

研究结果表明 ,V .natriegens可以利用葡萄糖、果糖、以及糖蜜为碳源合成聚羟基丁酸 [Poly(3HB) ];当以糖蜜为碳源时 ,积累的Poly(3HB)达到细胞干重的 2 8.4%。实验结果还表明 ,Poly(3HB)的积累滞后于细胞生长 ,在培养前加入过量的碳源 ,不仅没有Poly(3HB)积累 ,还抑制细胞的生长。测定了与Poly(3HB)合成相关的PHA聚合酶、β 酮硫解酶和乙酰乙酰CoA还原酶的活性。结果表明 ,伴随Poly(3HB)合成 ,PHA聚合酶活性从无到有 ,β 酮硫解酶活性提高了 10倍以上。进一步通过利用脂肪酸合成代谢抑制物———浅蓝菌素 (cerulenin) ,研究了脂肪酸从头合成途径与Poly(3HB)合成途径的关系 ,发现浅蓝菌素能够明显降低细胞Poly(3HB)的累积。根据以上结果 ,推测在V .natriegens中可能存在有两条代谢途径参与Poly(3HB)

关键词：需钠弧菌合成聚羟基丁酸 PHAs

新型生长快速需钠弧菌基因组无痕编辑体系构建

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生物工程学报 2020年第11期36卷 2387-2397页

作者：吴凤礼梁艳霞张媛媛霍亚楠王钦宏中国科学院天津工业生物技术研究所中国科学院系统微生物工程重点实验室天津300308 中国科学院大学北京100049 天津科技大学生物工程学院天津300457

需钠弧菌Vibrio natriegens作为近几年发展起来的一种新型生长快速底盘细胞,在合成生物学领域展现出良好的应用前景。基因组编辑是合成生物学研究中不可或缺的遗传操作手段。但是,开展需钠弧菌的合成生物学研究仍然有待进一步发展精准... 详细信息

需钠弧菌Vibrio natriegens作为近几年发展起来的一种新型生长快速底盘细胞,在合成生物学领域展现出良好的应用前景。基因组编辑是合成生物学研究中不可或缺的遗传操作手段。但是,开展需钠弧菌的合成生物学研究仍然有待进一步发展精准、高效的基因组编辑系统。针对这个问题,首先对6株需钠弧菌的生理表型进行检测,选取生长快速、表型稳定的CICC 10908菌株作为基因组编辑研究的宿主细胞。其次,建立并优化需钠弧菌自然转化系统。优化后的系统将筛选标记基因cat-sacB或KanR整合到需钠弧菌染色体上的同源重组效率分别达到4×10^–5和4×10^–4。再次,在优化的自然转化系统基础上,利用双向选择性筛选方法,建立了精准、高效的需钠弧菌基因组无痕编辑体系。通过测试,基因敲除、回补、插入和替换这4种不同类型基因编辑的阳性率分别为93.8%、100%、95.7%和100%。最后,需钠弧菌可以实现质粒的高效转化和消除。该工作为需钠弧菌合成生物学研究提供精准、高效的基因组无痕编辑手段。

关键词：需钠弧菌底盘细胞自然转化基因组编辑合成生物学

DH36钢在需钠弧菌、芽孢杆菌以及混菌腐蚀体系中的腐蚀行为

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表面技术 2020年第2期49卷 212-219页

作者：董硕贺小燕白秀琴袁成清武汉理工大学国家国家水运安全工程技术研究中心可靠性工程研究所武汉430063 武汉理工大学船舶动力工程技术交通行业重点实验室武汉430063

目的研究需钠弧菌与芽孢杆菌分别单独培养以及混合培养时对海洋工程钢DH36腐蚀行为的影响,为海洋环境下材料的腐蚀发生规律探讨以及微生物腐蚀防治提供依据。方法通过扫描电子电镜、能谱仪、电化学设备等仪器,分析DH36钢在不同腐蚀体系... 详细信息

目的研究需钠弧菌与芽孢杆菌分别单独培养以及混合培养时对海洋工程钢DH36腐蚀行为的影响,为海洋环境下材料的腐蚀发生规律探讨以及微生物腐蚀防治提供依据。方法通过扫描电子电镜、能谱仪、电化学设备等仪器,分析DH36钢在不同腐蚀体系中的腐蚀形貌信息以及电化学特征。结果SEM图显示,芽孢杆菌在DH36钢表面上的贴附量较大,需钠弧菌与混菌腐蚀体系中,生物膜、锈层构成的混合层存在很多的裂纹、缝隙,致密性较差。电化学结果显示,试样表面均出现两个时间常数,在低频处出现感抗特征。芽孢杆菌腐蚀体系中的腐蚀速率先增大后减小,浸泡3 d后需钠弧菌腐蚀体系中的腐蚀速率介于芽孢杆菌与混菌腐蚀体系之间。与单菌种腐蚀体系相比,混菌腐蚀体系中的开路电位最低,且浸泡7 d后的腐蚀速率最大,达到13.53μA/cm^2。结论在浸泡后期芽孢杆菌显示出腐蚀抑制效果,在需钠弧菌与混菌腐蚀体系中,由于细菌代谢产生了腐蚀性产物以及形成了致密性较差的混合层,试样腐蚀速率不断加快,但混菌的促进作用更显著。

关键词：海洋微生物腐蚀需钠弧菌芽孢杆菌 DH36钢电化学阻抗谱极化曲线

需钠弧菌外膜囊泡的蛋白质组分析与异源蛋白的递送(英文)

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微生物学通报 2021年第12期48卷 4564-4580页

作者：崔阳董涛上海交通大学生命科学技术学院上海200240

【背景】需钠弧菌(Vibrio natriegens)是一种快速生长的革兰氏阴性菌,作为一种新兴工具在生物技术领域有重要的应用潜力。此前的研究主要集中在开发利用V.natriegens成为体内外重组蛋白生产的工具。然而,许多支持细菌进行快速生长和蛋... 详细信息

【背景】需钠弧菌(Vibrio natriegens)是一种快速生长的革兰氏阴性菌,作为一种新兴工具在生物技术领域有重要的应用潜力。此前的研究主要集中在开发利用V.natriegens成为体内外重组蛋白生产的工具。然而,许多支持细菌进行快速生长和蛋白质生产的生理活动大部分仍未确定。外膜囊泡(Outer Membrane Vesicle,OMV)是由革兰氏阴性细菌普遍产生的一种球形小泡,其不仅具有重要的功能,而且还可以作为一种应用于疫苗治疗的高效运载工具。【目的】表征指数生长期OMV的蛋白质组并利用OMV进行异源蛋白的递送。【方法】使用透射电镜、动态光散射和质谱学的方法,观察OMV的形态及粒径分布并鉴定蛋白组成。以超折叠绿色荧光蛋白(Superfolded Green Fluorescent Protein,sfGFP)作为货物蛋白来确定OMV蛋白载体。【结果】从细菌培养的指数期中期和末期分别提取的OMV中鉴定到了288个和317个蛋白。这些蛋白分属不同的功能组,包括ABC转运蛋白、鞭毛、双组分系统。相比之下,同时鉴定了全细胞样品,其在指数期中期和末期分别含有1480个和1565个蛋白。我们筛选OMV的蛋白作为候选载体发现了一种属于OmpA家族的蛋白(命名为OmpA24),其能够将sfGFP以融合货物蛋白的形式运载到OMV中。【结论】首次证实V.natriegens能够在指数生长期产生OMV,并展示了第一个不同生长时期OMV和全细胞的蛋白质组鉴定结果。OmpA24是将外源融合货物蛋白呈递到OMV中的有前景的载体。本研究有助于促进V.natriegens在蛋白表达和OMV介导的分泌中的应用。

关键词：需钠弧菌外膜囊泡生物技术

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船用钢需钠弧菌附着腐蚀电化学噪声特征分析

南京航空航天大学学报 2016年第1期48卷 81-86页

作者：范春华李国祥刘伯洋吴钱林钟宁尹衍升上海海事大学海洋科学与工程学院上海201306

选取船用钢板DH34为研究对象,将试验钢板浸泡于需钠弧菌培养液中和无菌培养液中进行腐蚀试验,对比分析了该材料在需钠弧菌培养液中的腐蚀特征。采用扫描电镜观察腐蚀形貌,结果表明在需钠弧菌培养液中试样发生局部点蚀,而在无菌培养液中... 详细信息

选取船用钢板DH34为研究对象,将试验钢板浸泡于需钠弧菌培养液中和无菌培养液中进行腐蚀试验,对比分析了该材料在需钠弧菌培养液中的腐蚀特征。采用扫描电镜观察腐蚀形貌,结果表明在需钠弧菌培养液中试样发生局部点蚀,而在无菌培养液中则为全面腐蚀。对腐蚀过程进行了噪声电压和噪声电流的采集,时域和频域分析表明:在有需钠弧菌的培养液中,电压噪声功率谱的高频斜率高于-20dB/dec,截止频率大于0.2 Hz,起始两天噪声的点蚀指数接近于1;而在无菌的培养液中,电压噪声功率谱的高频斜率小于-20dB/dec,截止频率低于0.2Hz。需钠弧菌的培养液中噪声电阻值高于无菌培养液中噪声电阻值。点蚀指数、噪声功率谱密度的高频斜率和截止频率可用于判断需钠弧菌附着时船用钢板DH34的腐蚀行为。

关键词：微生物腐蚀需钠弧菌电化学噪声

需钠弧菌和芽孢杆菌对海洋金属材料的腐蚀行为研究

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需钠弧菌和芽孢杆菌对海洋金属材料的腐蚀行为研究

作者：董硕武汉理工大学

学位级别：硕士

微生物腐蚀(MIC)是海洋腐蚀的重要组成部分,材料浸入海洋之后,微生物会在表面附着生长,逐渐形成生物膜,不仅影响后续大型污损生物的附着,还改变材料表面的理化性质,与材料之间产生交互作用,参与腐蚀反应,进而加速或抑制腐蚀。在以往的... 详细信息

微生物腐蚀(MIC)是海洋腐蚀的重要组成部分,材料浸入海洋之后,微生物会在表面附着生长,逐渐形成生物膜,不仅影响后续大型污损生物的附着,还改变材料表面的理化性质,与材料之间产生交互作用,参与腐蚀反应,进而加速或抑制腐蚀。在以往的微生物腐蚀研究中,多以研究铁细菌与硫细菌为主,且往往是研究单类细菌的腐蚀,而浸海材料同时受到多种微生物的腐蚀威胁,其对腐蚀的共同影响需要深入研究。需钠弧菌与芽孢杆菌均是海洋中大量存在的细菌,但对它们的腐蚀研究相对较少。选取海洋工程钢DH36作为实验材料,运用电化学与现代表征技术测量方法,对比无菌人工海水腐蚀体系,研究浸泡7d内需钠弧菌、芽孢杆菌以及两种菌混合时对DH36钢的腐蚀行为影响。得到的主要结论如下:(1)无菌人工海水腐蚀体系中,浸泡3 d时试样腐蚀速度最小,此时试样表面被致密的铁氧锈层覆盖,Fe向溶液中的扩散过程受到抑制,加强了阳极极化现象,使阳极溶解受到抑制,之后锈层在人工海水冲击下变疏松,逐渐难以充当溶解氧阻隔层的作用,腐蚀速度开始增大。(2)需钠弧菌与芽孢杆菌均代谢产生了酸性腐蚀产物,恶化腐蚀环境。在浸泡前3 d内,单菌种对试样的腐蚀影响效果相似,均为加速腐蚀,且腐蚀速度大于无菌人工海水腐蚀体系。(3)浸泡3 d后,芽孢杆菌显示出抑制腐蚀发生的效果,原因在于试样表面形成的生物膜与锈层的混合层相对致密厚实,不仅阻碍Fe向溶液中的扩散,还阻挡溶解氧对试样基体的侵蚀,增大腐蚀阻力。浸泡7 d时腐蚀速度小于无菌人工海水体系。需钠弧菌持续加速腐蚀,其生物膜与锈层的混合层存在较多的缝隙、裂纹,腐蚀阻力较弱,且易引发氧浓差电池,使得腐蚀速度维持在较高水平。(4)需钠弧菌和芽孢杆菌混合培养时,两种菌对培养基中的营养物质与溶解氧具有竞争关系,芽孢杆菌多附着在锈层外围,并且形态与单芽孢杆菌培养时不同,尺寸较小,形态为圆球形,生存状态不佳。生物膜最终影响了锈层的堆积状态,混合膜层的粘连性很差,松散的菌体与腐蚀产物结合在裂开的膜层之间,局部氧浓差电池的发生加快着腐蚀进行。试样的腐蚀发展状况更接近于需钠弧菌腐蚀体系,但腐蚀结果更为严重。

关键词：海洋微生物腐蚀 DH36钢需钠弧菌芽孢杆菌多菌种腐蚀

文蛤病原菌——需钠弧菌的鉴定和生物学特性分析

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渔业科学进展 2009年第6期30卷 103-109页

作者：李国闫茂仓孙杰林志华马爱敏常维山山东农业大学泰安271018 浙江省海洋水产养殖研究所温州325005

从患病文蛤Meretrix meretrix体内分离出一优势菌株WT01,回归感染试验证明是文蛤的致病菌。对该菌形态、生理生化特征、盐度、温度和pH值生长条件以及16S rRNA基因序列进行了研究。结果表明,该菌为革兰氏阴性菌,发酵葡萄糖产酸不产气,... 详细信息

从患病文蛤Meretrix meretrix体内分离出一优势菌株WT01,回归感染试验证明是文蛤的致病菌。对该菌形态、生理生化特征、盐度、温度和pH值生长条件以及16S rRNA基因序列进行了研究。结果表明,该菌为革兰氏阴性菌,发酵葡萄糖产酸不产气,氧化酶阳性,生长需NaCl,无色素,不发光,在TCBS平板上形成圆形黄色菌落,对弧菌抑制剂O/129敏感,具有弧菌属的典型特征。16SrRNA基因序列分析表明,该菌与需钠弧菌Vibrio natriegen的亲缘关系最为接近,其同源性达99%以上。因此,将该菌鉴定为需钠弧菌。实验显示其半数致死量为5.5×106CFU/g。19种抗菌药物药敏试验结果表明,该菌对氟哌酸、复方新诺明、菌必治、先锋必、链霉素、氯霉素和庆大霉素等抗生素较为敏感。并对其胞外产物的生物学特性进行了分析。

关键词：文蛤需钠弧菌 16S rRNA 系统发育树生物学特性