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中华按蚊和雷氏按蚊实时荧光定量PCR鉴定方法的建立与应用

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应用昆虫学报 2023年第1期60卷 304-312页

作者：舒黄芳王可艺吴德林荣幸卢文成阮彩文邓卓晖张萌宋铁广东药科大学公共卫生学院广州510315 广东省疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所广州511430 广东省疾病预防控制中心传染病预防控制所广州511430 广东省疾病预防控制中心广州511430

【目的】建立中华按蚊Anopheles sinensis与雷氏按蚊Anopheles lesteri实时荧光定量PCR(qPCR)检测技术,为2种传疟按蚊的准确鉴定提供分子鉴定方法。【方法】建立2种按蚊的样本库,利用形态学方法和基因测序对蚊虫样本进行鉴定;合成并克... 详细信息

【目的】建立中华按蚊Anopheles sinensis与雷氏按蚊Anopheles lesteri实时荧光定量PCR(qPCR)检测技术,为2种传疟按蚊的准确鉴定提供分子鉴定方法。【方法】建立2种按蚊的样本库,利用形态学方法和基因测序对蚊虫样本进行鉴定;合成并克隆阳性质粒质控品。从NCBI数据库上下载中华按蚊和雷氏按蚊的rDNA-ITS2序列,利用Prime3软件在线设计2种按蚊的引物和探针,并验证该PCR方法的最低检测限、敏感性、特异性和可重复性。【结果】收集并鉴定4种383头蚊虫,其中中华按蚊159头、雷氏按蚊104头、致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus 60头和白纹伊蚊Aedes albopictus 60头。中华按蚊和雷氏按蚊的qPCR的最低检测限均为31.50拷贝/反应,标准曲线线性关系相关系数(R^(2))均为0.99。敏感性和特异性均为100%,重复性试验结果显示,中华按蚊和雷氏按蚊的组内和组间变异系数均小于2%。【结论】本方法所建立的TaqMan探针qPCR方法灵敏度高,特异性高,可用于中华按蚊和雷氏按蚊的分子鉴别。

关键词：中华按蚊雷氏按蚊 TaqMan探针实时荧光定量PCR

应用形态、染色体和分子特征研究我国雷氏按蚊的分类鉴别(双翅目:蚊科)

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Entomotaxonomia 2005年第3期27卷 199-208页

作者：马雅军杨频徐建农陈哲潘波第二军医大学病原生物学教研室 Center for Microbial and Plant Genomics University of Minnesota 1500 Gortner AvenueSaint.PaulMN55108USA 辽宁省东港市疾病预防控制中心广东省寄生虫病防治研究所

为确定可靠的雷氏按蚊Anopheleslesteri Baisaset Hu,1936分类鉴别特征,对采自不同地区的雷氏按蚊进行了形态、染色体和分子特征的观察和分析。检视了辽宁、广东现场标本,江苏实验室品系的成蚊、虫卵特征,描述了染色体核型,并测定了采... 详细信息

为确定可靠的雷氏按蚊Anopheleslesteri Baisaset Hu,1936分类鉴别特征,对采自不同地区的雷氏按蚊进行了形态、染色体和分子特征的观察和分析。检视了辽宁、广东现场标本,江苏实验室品系的成蚊、虫卵特征,描述了染色体核型,并测定了采自广东、辽宁、河南和云南4省的现场标本,以及江苏、海南和广西实验室品系的核糖体DNA间隔2区(ITS2)和D3序列。结果显示成蚊、虫卵形态变异较大,不具备稳定、明确的鉴别特征;染色体核型具有多态现象,性染色体X、Y分别有3个和2个类型,可分为染色体型A与B;唯有ITS2分子序列具有客观、稳定的种间差异,系雷氏按蚊可靠、可行的鉴别特征。

关键词：双翅目雷氏按蚊形态染色体核型核糖DNA

基于mtDNA-COI基因序列的雷氏按蚊分子群体遗传结构研究

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昆虫学报 2009年第9期52卷 1000-1007页

作者：杨曼尼马雅军第二军医大学病原生物学教研室上海200433

【目的】探讨我国雷氏按蚊Anopheles lesteri的群体差异和分化程度。【方法】采用PCR方法,从分子水平鉴别了采自我国和韩国的雷氏按蚊共9个群体139个样本,扩增其线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因,并进行序列测定和分析。【结果】本研... 详细信息

【目的】探讨我国雷氏按蚊Anopheles lesteri的群体差异和分化程度。【方法】采用PCR方法,从分子水平鉴别了采自我国和韩国的雷氏按蚊共9个群体139个样本,扩增其线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因,并进行序列测定和分析。【结果】本研究共获得49个单倍型,各单倍型呈高水平的平行演化,来自云南群体的单倍型显示是扩张的源头。分子变异等级分析(AMOVA)的计算结果显示,群体内变异占总变异的比例(64.95%)大于群体间(35.05%),FST值为0.3504,各群体间出现遗传分化。Mantel检验结果显示基因流水平与地理距离呈负相关关系(R2=0.1322),群体遗传结构符合距离隔离模型。【结论】雷氏按蚊韩国和辽宁群体与其他分布地群体间差异大,已出现明显分化,我国其他分布地群体间的遗传差异小。

关键词：雷氏按蚊群体遗传结构线粒体DNA 单倍型中国

基于多态微卫星DNA的中国雷氏按蚊群体遗传结构研究

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中国媒介生物学及控制杂志 2021年第5期32卷 526-532页

作者：周秋明林琳董昊炜袁浩白洁李翔宇彭恒马雅军海军军医大学海军医学系上海200433 海军军医大学基础医学院病原生物学教研室上海200433

目的应用微卫星DNA检测中国雷氏按蚊群体的遗传差异和结构,探讨群体遗传分化的影响因素。方法用吸蚊管人工吸取成蚊,依据形态与核糖体DNA第2内转录间隔区分子特征鉴定雷氏按蚊,对9个微卫星位点进行基因扫描,基于微卫星DNA的片段长度多态... 详细信息

目的应用微卫星DNA检测中国雷氏按蚊群体的遗传差异和结构,探讨群体遗传分化的影响因素。方法用吸蚊管人工吸取成蚊,依据形态与核糖体DNA第2内转录间隔区分子特征鉴定雷氏按蚊,对9个微卫星位点进行基因扫描,基于微卫星DNA的片段长度多态性,计算群体内和群体间的遗传差异,Structure软件推论分支数,并计算有效群体规模。结果在17个采集地获取雷氏按蚊216只,合并为9个群体进行分析。雷氏按蚊群体平均等位基因数范围为3.22~7.44,平均期望杂合度和观察杂合度范围分别为0.48~0.71和0.33~0.47;群体间固定指数范围为-0.01~0.25,平均为0.13;群体内的遗传变异(86.55%)远大于群体间(13.45%),群体间的遗传变异水平与地理距离呈正相关。Structure结果显示雷氏按蚊群体可划分成2支,第Ⅰ支包括辽宁和广东群体,第Ⅱ支包括我国的海南、湖北、河南、云南、四川群体和韩国群体。结论我国雷氏按蚊群体的遗传变异主要存在于群体个体间,其变异水平中等,群体遗传结构符合地理隔离模型。研究结果提示雷氏按蚊属于2个基因库,云南群体为原始基因库,向东、北方向扩散的过程中,逐渐出现另一基因库的个体。

关键词：雷氏按蚊微卫星DNA 群体遗传群体结构

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辽宁省雷氏按蚊分布和构成

中国公共卫生 2014年第4期30卷 475-477页

作者：丁俊禇发军耿英芝张稷博王树诚白玉银王纯玉辽宁省疾病预防控制中心沈阳110005 东港市疾病预防控制中心

目的掌握辽宁省疟疾传播媒介雷氏按蚊的构成和分布,为制定媒介按蚊控制策略提供科学依据。方法利用形态学和分子生物学方法对2010年在辽宁省沈阳、大连、丹东、锦州和铁岭市等不同地理环境采集到的按蚊进行种类鉴定。结果分子生物学鉴... 详细信息

目的掌握辽宁省疟疾传播媒介雷氏按蚊的构成和分布,为制定媒介按蚊控制策略提供科学依据。方法利用形态学和分子生物学方法对2010年在辽宁省沈阳、大连、丹东、锦州和铁岭市等不同地理环境采集到的按蚊进行种类鉴定。结果分子生物学鉴定结果显示,沈阳、大连、丹东、锦州和铁岭市雷氏按蚊物种构成比分别为26%、66%、73%、33%和83%,铁岭最高,沈阳最低;形态学鉴定显示,沈阳、大连、丹东、锦州和铁岭市雷氏按蚊物种构成比分别为30%、74%、80%、33%和72%;5个市PCR鉴定和形态学鉴定雷氏按蚊构成结果的比对,经统计学检验差异无统计学意义。结论雷氏按蚊在沈阳、大连、丹东、锦州和铁岭市均有分布,并且在大连、丹东和铁岭市为优势种;初步证实中国雷氏按蚊分布的北部边界已向北推移至北纬43°26'的铁岭市。

关键词：疟疾雷氏按蚊分布辽宁省

应用微卫星DNA标志研究我国雷氏按蚊群体遗传结构

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应用微卫星DNA标志研究我国雷氏按蚊群体遗传结构

作者：林琳第二军医大学

学位级别：硕士

雷氏按蚊Anopheles lesteri Baisas & Hu 1936,隶属按蚊属(Genus Anopheles)、赫坎按蚊种团(An. hyrcanus group),分布于菲律宾、中国、日本、韩国和关岛等地,就医学重要性而言,仅在我国中部具有较高的传疟效能。多年的调查显示,雷氏按... 详细信息

雷氏按蚊Anopheles lesteri Baisas & Hu 1936,隶属按蚊属(Genus Anopheles)、赫坎按蚊种团(An. hyrcanus group),分布于菲律宾、中国、日本、韩国和关岛等地,就医学重要性而言,仅在我国中部具有较高的传疟效能。多年的调查显示,雷氏按蚊在我国不同地理分布区,生态习性和传病能力也存在一定差异,故亟待深入研究雷氏按蚊的群体的遗传差异。本研究应用分子特征首先鉴别我国的按蚊样本;在研究雷氏按蚊多态微卫星DNA位点特征的基础上,应用多态的微卫星DNA位点检测我国雷氏按蚊群体遗传结构。依据分子特征鉴别我国的按蚊样本,提高了准确性,在一定程度上补充和更新了各地按蚊的本地资料。雷氏按蚊不同群体的遗传差异程度,以及群体分化等问题的阐明,可望为制定媒介区的疟疾控制策略提供理论依据。课题研究策略如下:首先,对我国不同分布地的按蚊样本依据rDNA的2个标志,即ITS2和D3,进行分子鉴定;之后,对课题组已分离的雷氏按蚊微卫星DNA位点应用现场样本进行GENESCAN扫描,研究各位点的基本特征;应用获得的多态微卫星位点检测我国雷氏按蚊的群体内和群体间的遗传差异。取得如下主要结果:1.本研究分子鉴定的样本来自云南、湖北、贵州、河南、广东、山东、辽宁、陕西和海南共126个样本,序列分析结果显示包括:中华按蚊(An. sinensis)(n=44)、迷走按蚊(An. vagus)(n=22)、暗灰按蚊(An. pullus) (n=18)、微小按蚊(An. minimus)(n=13)、林氏按蚊(An. lindesayi)(n=10)、克莱按蚊(An. kleini)(n=4)、筠连按蚊(An. junlianensis)(n=4)、腹簇按蚊(An. kochi)(n=4)、比伦按蚊(An. belenrae)(n=3)、贵阳按蚊(An. kweiyangensis)(n=3)和乌头按蚊(An. aconitus)(n=1)。2.序列分析发现存在4类无法定名的种类,即LL1、LL2、LL3和LL4,除LL4外,其他3类均与赫坎按蚊种团成员种最为近似,应是该种团的新成员种。另外,在多种按蚊中发现个体内的碱基双峰现象,提示这些按蚊物种近期分化活跃,处于隐种形成中(speciation)。3.应用分子鉴定确认的雷氏按蚊现场57个样本,研究了雷氏按蚊11个多态微卫星DNA的基本特征,为进一步检测雷氏按蚊的群体遗传结构提供了新的分子标志。4.应用9个多态的微卫星DNA位点检测了采自我国17个,以及韩国1个采集地的雷氏按蚊样本共216个,各行政省份合并后成1个群体,将获得的9个群体进行后续分析。5.雷氏按蚊群体内遗传差异的分析结果可见,平均期望杂合度和观察杂合度的范围为0.4848(江苏)～0.7134(辽宁)和0.3309(江苏)～0.4704(韩国);在辽宁群体中自有等位基因最多(9),而云南群体无自有等位基因;近交系数范围为0.2101(海南)～0.5037(湖北),平均为0.3508;经检验,总共30个位点偏离哈代-温伯格平衡,辽宁群体中的位点最多(7),在韩国、云南和湖北群体无位点偏离;连锁不平衡的检验结果显示,存在连锁关联的共38对位点(P雷氏按蚊群体间遗传差异分析时去除江苏群体(实验室品系),以及位点ANL11。分析结果可见,成对群体间的FST范围为-0.0127(辽宁与韩国)～0.2539(云南与海南);Mantel检验结果显示群体间遗传差异与地理距离为正相关关系,群体遗传结构符合地理隔离模型;分子变异等级分析显示雷氏按蚊的变异主要存在于群体内,占总变异的86.55%,群体间的变异仅占总变异的13.45%;贝叶斯法的分析结果均显示所有群体可分为2个支,分支I包括广东和辽宁群体,分支II包括即韩国、河南、湖北、广东、海南和四川群体。7.雷氏按蚊群体的稳定性和规模的分析结果可见,河南、湖北、海南和辽宁共4个群体经历了近期群体的扩张;基于连锁不平衡模型,群体规模的范围为1.2(湖北)～33.7(广东),总体的群体规模为44.6,95%置信区间为40.6～49.0。8.综合分析雷氏按蚊的群体遗传结构,可以推测雷氏按蚊的祖先群体来自云南,其他群体均为扩散而至,向北、东迁移和扩散,在途中定殖,为适应当地生态环境出现一定比例的变异。雷氏按蚊分布广泛,地理屏障虽在一定程度上阻碍基因的交流,但群体间差异并不大,群体遗传结构符合地理隔离模型(Isolation-by-distance Model)。因其在我国中部的医学重要性,故在分布地长期

关键词：雷氏按蚊分子鉴别群体遗传微卫星DNA

中华按蚊物理图谱构建及中华按蚊与雷氏按蚊多线染色体比较分析

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中华按蚊物理图谱构建及中华按蚊与雷氏按蚊多线染色体比较分析

作者：程彪南京农业大学

学位级别：硕士

中华按蚊(Anophelessinensis)属于双翅目(Diptera)蚊科(Culicidae)按蚊属(Anopheles genus)按蚊亚属(Anopheles subgenus)的赫坎按蚊种团的(Anopheles hyrcanus group)是我国重要的疟疾(malaria)和丝虫病(filariasis)的传播媒介,除青海和新疆之外皆有广泛分布。按蚊高分辨率染色体图谱是鉴定近似种和复合体内小种以及地理株的重要手段,也是构建物理图谱(physicalmap)的前提条件。近年来,中华按蚊全基因组序列的相继发表为其生态习性和传疟能力的研究打下了坚实的基础,但是中华按蚊物理图谱的缺乏严重阻碍了中华按蚊进化分析以及相关的研究。本研究中,通过分析已经发表的中华按蚊全基因组数据,我们选择52个Scaffold来进行物理图谱的构建。根据每个Scaffold首尾两端的特异序列分别设计两个DNA荧光探针进行标记,利用荧光原位杂交技术将其定位到中华按蚊的多线染色体上。本项目总共将104个DNA荧光探针定位到染色体上,构建的中华按蚊物理图谱包含有52个中华按蚊大片段Scaffold的染色体位置,总长度为83.43 Mb,占总组装的全基因组序列(220.8Mb)的38%,其中有48个Scaffold已经确定了方向,其余的Scaffold因为其片段太小而无法确定方向。在3R染色体臂上共定位14个Scaffold是中华按蚊染色体臂中定位最多的一条,而其总基因组长度仅为11.01Mb,是所有染色体臂基因组总长度最短的。2R染色体臂定位Scaffold数量适中,是所有染色体臂中基因组总长度最长的,占中华按蚊总基因组长度的10%。AS2cf7180000696055是所有Scaffold中最长的,其大小为5,918,260 bp,占总基因组的2.68%,被定位在3L染色体臂的38C-39C之间的区域。这是到目前为止完成的第一幅中华按蚊物理图谱,为中华按蚊的比较基因组学(comparativegenomics)以及染色体进化分析(chromosomeevolution analysis)等研究提供巨大的便利。雷氏按蚊(Anopheleslesteri)也是赫坎按蚊种团的一员,是中华按蚊的近缘种。二者在形态上十分相似,利用传统的鉴定方法很难将两者区分开来。雷氏按蚊同样具有高品质的唾液腺多线染色体,其染色体带纹与中华按蚊的染色体大体相似,但在某些染色体片段上存在显著差异,因此可以用来作为两个物种鉴定的细胞遗传学标志。对两者染色体差异的研究对揭示传疟能力的不同具有重要的研究意义。本研究中,我们构建了一副雷氏按蚊的高分辨多线染色体图谱,并将其与发表的中华按蚊染色体图谱进行了比较分析,并详细描述了染色体带纹的差异,为鉴别雷氏按蚊和中华按蚊提供了一种有效的方法。利用荧光原位杂交技术,将31个保守的中华按蚊和冈比亚按蚊的DNA探针定位在雷氏按蚊的多线染色体上。经过比较发现两种蚊虫的染色体臂具有高度的同源性,即中华按蚊的X、2R、2L、3R、3L染色体臂分别对应雷氏按蚊的X、2R、2L、3R、3L染色体臂。此结果进一步证实了两个蚊种进化上的亲缘关系。本研究构建的雷氏按蚊的高分辨染色体图谱及与中华按蚊染色体的比较分析为两个蚊种的分类鉴定以及传病能力差异等的研究奠定了理论基础。

关键词：中华按蚊荧光原位杂交染色体图谱物理图谱雷氏按蚊