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中国动脉硬化杂志 2023年第7期31卷 581-587页

作者：李玉婷冯森玲林彩燕贾梦磊钟文飞严鹏科广州医科大学附属第三医院药学部广州医科大学药学院广东省产科重大疾病重点实验室广东省广州市510510

[目的]探讨雷帕霉素脂质体(RL)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)迁移的影响及其与S100钙结合白蛋白A4(S100A4)相关的作用机制。[方法]使用敲低S100A4基因的慢病毒转染HA-VSMC,随后加入嘌呤霉素筛选S1... 详细信息

[目的]探讨雷帕霉素脂质体(RL)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)迁移的影响及其与S100钙结合白蛋白A4(S100A4)相关的作用机制。[方法]使用敲低S100A4基因的慢病毒转染HA-VSMC,随后加入嘌呤霉素筛选S100A4基因敲低的稳定株。50 mg/L ox-LDL处理HA-VSMC,加入不同剂量的RL(3、6及12 mg/L),观察处理前后对细胞迁移的影响。采用细胞划痕法、Transwell实验检测细胞迁移,Western blot检测S100A4、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、波形蛋白的表达。[结果]ox-LDL处理细胞48 h后,与空白对照组相比,S100A4、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、COLⅠ及波形蛋白的表达明显升高(P<0.05),细胞迁移速度明显加快(P<0.05)。与ox-LDL组相比,不同剂量的RL处理48 h后显著抑制S100A4、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、COLⅠ及波形蛋白的表达并显著抑制细胞迁移(P<0.05),其中6 mg/L、12 mg/L RL的抑制作用更明显(P<0.05)。敲低S100A4基因后细胞迁移率显著降低(P<0.05)。[结论]RL能显著抑制ox-LDL诱导的HA-VSMC迁移,可能与RL下调S100A4、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、COLⅠ及波形蛋白的表达相关。

关键词：血管平滑肌细胞雷帕霉素脂质体氧化型低密度脂蛋白 S100钙结合白蛋白A4

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雷帕霉素脂质体抗结肠癌作用及其机制研究

雷帕霉素脂质体抗结肠癌作用及其机制研究

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作者：陈亦清广州医科大学

学位级别：硕士

雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）是一种新型大环内酯类免疫抑制剂,文献报道Rapa对于结肠癌、膀胱癌、宫颈癌等具有细胞毒作用,但在体内的抗肿瘤效果差。并且Rapa具有的水溶性差,生物利用度低等问题,进一步限制了其在临床上的应用。Rapa的衍... 详细信息

雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）是一种新型大环内酯类免疫抑制剂,文献报道Rapa对于结肠癌、膀胱癌、宫颈癌等具有细胞毒作用,但在体内的抗肿瘤效果差。并且Rapa具有的水溶性差,生物利用度低等问题,进一步限制了其在临床上的应用。Rapa的衍生物依维莫司改善了其水溶性问题,但临床上也仅用于晚期肾癌、胰腺癌的二线治疗。因此,我们推测仅仅改善Rapa的水溶性而不提高其在体内肿瘤部位的富集是不能有效地提高其抗肿瘤效果,所以如何高效地将药物靶向递送到达肿瘤部位是我们所需要研究的新的治疗方向。根据我们课题组过去的研究,我们采用脂质体包裹Rapa来制备雷帕霉素脂质体（Rapamycin Liposomes,Rapa LPs）。通过体内和体外研究来考察Rapa LPs的体外细胞毒作用、体内分布和治疗结肠癌效果等。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）是结肠癌的一线化疗基础药物,但是,它对正常细胞存在一定的毒副作用并且容易产生耐药,因此,我们首先研究Rapa LPs的抗肿瘤作用是否优于Rapa原料药,再进一步考察Rapa LPs与5-FU联用是否能提高了治疗结肠癌的效果,并研究其抗肿瘤机制。本论文的主要研究内容如下:第一章:雷帕霉素脂质体的构建及表征目的:制备雷帕霉素纳米结构脂质载体。方法:乙醇注入法制备Rapa LPs;动态光散射法分析脂质体的Zeta电位和粒径;透射电镜法（TEM）观察其形态和大小;高效液相色谱法（HPLC）测定其载药量和包封率;细胞摄取实验观察细胞对药物的摄取;MTT法测试了Rapa和Rapa LPs对结肠癌细胞的毒性作用。结果:Rapa LPs粒径约为100±5.5 nm,多分散系数（PDI）为0.125-0.25,Zeta电位接近中性。透射电镜结果表明,Rapa LPs呈球形,大小均一,其粒径与DLS测定结果相似。Rapa LPs的包封率为80±2.5%,载药量为9±0.5%,具有较好的载药效果。细胞摄取实验结果显示Rapa LPs组对药物的摄取量比Rapa原料组的高。MTT结果显示,Rapa LPs作用于HCT-116细胞和SW480细胞48h后,其半数抑制浓度(50%concentration of inhibition,IC)分别为5.61±0.75μg/mL、7.52±0.51μg/mL,而Rapa原料药作用于HCT-116细胞和SW480细胞48h后,其半数抑制浓度分别为15.34±1.18μg/mL、12.22±1.08μg/mL。结论:制备的Rapa Lps包封率、载药量高。与相同浓度的Rapa原料药相比,Rapa LPs可以促进药物的摄取,且对结肠癌细胞毒作用更强。第二章:雷帕霉素脂质体的体内抗肿瘤作用目的:考察Rapa LPs在体内的分布和研究雷帕霉素脂质体、5-FU及两药联合使用的体内抗肿瘤作用,并探讨其可能的机制。方法:构建HCT-116荷瘤裸鼠模型,制作DIR脂质体,尾静脉注射DIR脂质体,采用活体成像法观测给药后小鼠体内的荧光分布;其次,分别考察了Rapa原料药、Rapa LPs、5-FU及Rapa或Rapa LPs联合5-FU组的体内抗结肠癌作用;利用HE染色、Ki67免疫组化、TUNEL染色检测肿瘤组织细胞增殖及凋亡的情况。结果:首先,注射DIR脂质体24 h后,肿瘤组织的荧光增强,而DIR组的肿瘤组织并没有荧光分布;其次,Rapa LPs组的抗肿瘤效果优于Rapa原料药组（P脂质体能使更多的药物在肿瘤部位富集,Rapa LPs组的体内抗肿瘤作用优于Rapa原料药,且Rapa LPs联合5-FU组明显优于Rapa LPs或5-FU单药处理组,具有协同治疗结肠癌的作用。第三章:雷帕霉素脂质体的体外抗肿瘤的作用目的:研究雷帕霉素脂质体、5-FU及两药联合使用对人结肠癌HCT-116和SW480细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。方法:MTT法观察Rapa LPs联合5-FU在体外HCT-116和SW480细胞上的抗肿瘤作用;流式凋亡试剂盒检测肿瘤细胞凋亡情况;Transwell迁移实验检测肿瘤细胞迁移的情况;最后,Western blot法检测相关蛋白的表达。结果:与Rapa原料药相比,Rapa LPs能更好的抑制HCT-116和SW480细胞增殖和迁移,并诱导细胞发生凋亡,且Rapa LPs和5-FU两药联合处理的效果优于Rapa LPs或5-FU单药处理组。Rapa LPs、5-FU通过抑制上皮细胞间质转型的相关蛋白抑制细胞侵袭迁移。结论:Rapa

关键词：雷帕霉素脂质体 5-氟尿嘧啶协同作用结肠癌

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