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球等鞭金藻隐花色素基因家族相关研究

球等鞭金藻隐花色素基因家族相关研究

作者：龚林福建师范大学

学位级别：硕士

隐花色素(cryptochrome)是一类重要的蓝光受体,广泛存在于各种动植物、细菌等生物体内。隐花色素对植物的色素累积、叶绿体形成等相关生理生化活动起到重要作用。研究表明,蓝光可参与调控莱茵衣藻叶绿素及类岩藻黄素合成等相关生理过程... 详细信息

隐花色素(cryptochrome)是一类重要的蓝光受体,广泛存在于各种动植物、细菌等生物体内。隐花色素对植物的色素累积、叶绿体形成等相关生理生化活动起到重要作用。研究表明,蓝光可参与调控莱茵衣藻叶绿素及类岩藻黄素合成等相关生理过程,球等鞭金藻富含岩藻黄素(fucoxanthin)和多不饱和脂肪酸等代谢产物质,因此蓝光及隐花色素基因对球等鞭金藻上述代谢物质合成积累应该起到积极调控作用。本实验通过查找鉴定球等鞭金藻隐花色素基因并进行基因克隆及电击转化的探索,为后续研究隐花色素结构与功能提供重要前提;通过对球等鞭金藻进行ARTP诱变、光质培养,从基因工程和培养条件两方面入手,旨在提高藻株产岩藻黄素和脂肪酸能力,在获取高产岩藻黄素、DHA优良藻株和合适培养条件进行积极有益探索。本文主要研究内容和结果如下:1、利用本实验室构建的球等鞭金藻基因组和转录组数据库,再通过多种生物信息学分析网站和软件,发掘到球等鞭金藻隐花色素家族基因5个。对球等鞭金藻5个隐花色素基因编码蛋白进行包含一、二、三级结构,磷酸化位点、跨膜结构域和亚细胞定位等相关理化性质分析,并从同源序列、进化树角度上进行相关分析,结果表明5条基因与赫氏圆石藻隐花色素基因关系尤为密切,其中IZCRY1与赫氏圆石藻CRY1的亲缘关系最为相近;IZCRY3与赫氏圆石藻CRY3两者亲缘关系最密切;IZCRY4与赫氏圆石藻CRY4处于同一小分支上,关系密切。2、通过分子生物学手段,克隆得到球等鞭金藻3个隐花色素基因全长DNA序列。以重叠延伸PCR方式得到IZCRY1基因全长c DNA序列,随后通过无缝克隆的方式构建该基因过表达载体p Pha-IZCRY1,对球等鞭金藻进行IZCRY1基因电击转化以及阳性克隆筛选,初步建立球等鞭金藻电击转化体系。结果表明电击转化后的藻株在浓度20 ng/m L的博来霉素抗性平板上长出的单藻落长势明显优于野生藻株。3、通过对球等鞭金藻进行ARTP诱变育种实验,初筛筛选出生长速率快的诱变藻株若干株。复筛以生物量、岩藻黄素产量、总脂肪酸含量和DHA含量为标准,在这四个方面均筛选得到表现优于野生藻株的诱变藻株数株。其中,MT2、MT4、MT5、MT7在生物量上较野生藻株分别提高34.07%、20.51%、66.85%、28.57%;筛选得到高产岩藻黄素诱变藻株MT4、MT5、MT6三株。总脂肪酸含量方面,诱变藻株MT4、MT5明显高于野生藻株,其中,MT3、MT4单不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量均明显优于野生藻株。在产DHA方面,MT4和MT5表现优异,与野生藻株比较,在每升藻液体系中的DHA含量分别高出37%和41%,单细胞DHA含量分别高出17.19%和39.18%。4、在光质培养箱中分别采用白光、蓝光两种不同光质培养球等鞭金藻,培养一周,期间每天取样进行细胞计数以及不同光质下岩藻黄素和脂肪酸以及DHA含量差异检测。实验结果显示,蓝光培养条件下细胞生长状态比白光略差,而且蓝光对提高球等鞭金藻脂肪酸总量促进作用不明显,但是对岩藻黄素和DHA含量起着一定程度的促进作用。球等鞭金藻岩藻黄素和DHA含量在蓝光、白光培养条件下均呈现先上升后下降的趋势。

关键词：球等鞭金藻隐花色素基因克隆 ARTP 岩藻黄素 DHA

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水稻隐花色素基因调控生长发育的功能研究

水稻隐花色素基因调控生长发育的功能研究

作者：戴飞福建农林大学

学位级别：硕士

隐花色素是一种对植物生长发育起调节作用的蓝光受体。它在植物的去黄化、基因的表达调控、光周期的开花诱导等方面具有重要作用。但迄今,对重要农作物水稻隐花色素基因的功能研究甚少。本实验利用6个水稻隐花色素基因沉黙的转基因水稻... 详细信息

隐花色素是一种对植物生长发育起调节作用的蓝光受体。它在植物的去黄化、基因的表达调控、光周期的开花诱导等方面具有重要作用。但迄今,对重要农作物水稻隐花色素基因的功能研究甚少。本实验利用6个水稻隐花色素基因沉黙的转基因水稻为材料,对其进行长、短日照和各种光质的处理,系统研究了水稻三个隐花色素基因(cry1a、cry1b、cry2)在调控水稻生长发育中的功能,得到如下研究结果。种植本实验室已得到的转隐花色素基因的RNAi和反义RNA水稻T1-T3代株系材料,从T1代起于苗期进行GUS检测,筛选出纯合系,结果每个载体均分别得到了3至5个纯合系,分别是:cry1a+cry1b+cry2 RNAi沉黙水稻得到了5个纯合系,cry1a+cry1b RNAi沉默水稻得到了4个纯合系;cry1a和cry2 RNAi沉黙水稻分别得了3个纯合系,cry1a和cry2 anti-RNA沉黙水稻分别得4个纯合系。不论是在长日照还是短日照条件下,转三个隐花色素基因的RNA沉默水稻的开花时间都不同程度的晚于野生型,长日照处理的开花时间相对短日照处理水稻更迟。不同RNA干扰体,以RNAi干扰同时沉黙 cry1a、cry1b和cry2三个基因表达的水稻开花最迟,RNAi沉黙两个基因的(cry1a和cry1b)开花亦迟,RNAi分别沉黙单个基因水稻开花推迟较少,而以反义RNA干扰单基因表达水稻开花推迟最小。说明三个隐花色素基因都具有促进水稻开花的作用。在蓝光和白光条件下,转基因水稻的胚芽鞘和叶鞘都比野生型的长,转不同基因的RNA沉黙水稻表现有所不同,其胚芽鞘和叶鞘长度表现为:转cry1a+cry1b+cry2 RNAi水稻>转cry1a+cry1b RNAi水稻>转cry1a和cry2 RNAi水稻>cry1a和cry2 anti-RNA沉黙水稻>日本晴水稻。而在红光和黑暗条件下,转沉黙隐花色素基因水稻与野生型没有明显的差异。说明隐花色素基因具有抑制胚芽鞘和叶鞘伸长的作用。用RT-PCR分析了不同转化体水稻的在不同光质下光调控基因的表达,RNAi沉默隐花色素基因水稻,在各种光质条件下其隐花色素基因表达均减弱,且表达量较转anti-RNA沉黙隐花色素基因水稻的低;而不同隐花色素基因沉黙体水稻中光敏素基因的表达量基本一致。在蓝光下调节CHS、CHI的表达量是:三基因沉黙水稻的<二基因沉黙

关键词：隐花色素 RNA干扰基因表达生长发育水稻

南极衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L隐花色素基因克隆及表达调控研究

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南极衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L隐花色素基因克隆及表达调控研究

作者：张欣青岛大学

学位级别：硕士

光对生物体光合作用和生长发育具有重要作用,藻类的生长和发育与光有密切关系。隐花色素(cryptochrome,CRY)是一种接收蓝光(440～460 nm)与近紫外光UVA(320～400 nm)的光受体,属于隐花色素/光修复酶家族,参与了动物、植物乃至微生物中... 详细信息

光对生物体光合作用和生长发育具有重要作用,藻类的生长和发育与光有密切关系。隐花色素(cryptochrome,CRY)是一种接收蓝光(440～460 nm)与近紫外光UVA(320～400 nm)的光受体,属于隐花色素/光修复酶家族,参与了动物、植物乃至微生物中的光反应及生物钟的调控。目前对隐花色素的研究主要集中在陆生植物,对植物隐花色素结构、生物学功能、光激发及信号转导调控机制研究方面取得长足进展,但对海洋微藻隐花色素研究较少,尤其尚未见极地海洋微藻隐花色素的相关研究。南极衣藻长期在低温、高盐、季节性光照和强紫外辐射等海冰环境中生长和繁殖,对低温、高盐等逆境具有很强的适应能力。本文率先开展南极衣藻隐花色素研究,不仅有助于了解南极衣藻隐花色素的功能和作用机理,阐释海洋藻类光调节过程,还可为研究极地藻类对极端环境的适应性奠定基础。目的:本研究主要开展南极衣藻Chlamydomonas ***-L隐花色素基因克隆及表达调控研究,明确***-L隐花色素蓝光信号的响应及其在调节节律性光过程中的作用,探讨南极衣藻隐花色素受光诱导的调控功能,探索南极衣藻生物钟的调控机制,为进一步探讨南极冰藻环境适应的分子机理奠定理论基础。方法:1.根据南极衣藻***-L转录组测序结果,通过分子生物学技术克隆隐花色素基因CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1,并进行生物信息学分析。2.选取温度、盐度、光质、光周期、紫外条件对南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因进行实时荧光定量PCR分析,检测其转录调控水平。3.构建南极衣藻隐花色素基因CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1原核表达体系。4.通过Water-PAM测定南极衣藻在不同条件(紫外UVA和UVB、不同光质和光周期)的叶绿素荧光参数,分析细胞的最大光化学效率(Fv/Fm)和非光化学猝灭(NPQ)。结果:1.克隆获得南极衣藻隐花色素基因Ci CRY-DASH1和CiPlant-CRY1全长,并进行初步生物信息学分析。CiCRY-DASH1有1836个碱基对,编码608个氨基酸,其蛋白分子量为67.35 kDa;CiPlant-CRY1有1452个碱基,编码483个氨基酸,其蛋白分子量为52.32 kDa。系统发育树分析表明CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1与莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii以及绿藻属*** C-169的进化关系最近。2.完成了南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因的实时荧光定量PCR分析。研究结果表明,CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因在低温处理与最适温度下转录变化都有一定的趋势,即具有温度补偿性,进一步证实其为生物钟的关键组分。CiCRY-DASH1和Ci Plant-CRY1基因在最适盐度32‰时的表达量最高,且呈现一定的规律性。CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因在不同光质(白光、蓝光、绿光、黄光和红光)下的表达量可以发现,它能有效地响应各种不同光质的处理,特别是蓝光、黄光和红光,表明它可能参与了蓝光、黄光甚至是红光下的光信号转导途径。CiCRY-DASH1和Ci Plant-CRY1基因的表达能响应极昼和极夜处理,且响应能力强,并表现出一定的昼夜节律性。在紫外胁迫条件下,CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因对UVB和紫光敏感。3.构建了南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因的原核表达体系。成功构建原核表达载体pEASY-Blunt E2-Ci CRY-DASH1和pEASY-Blunt E2-CiPlant-CRY1,并将其转化到Transetta(DE3)表达感受态细胞中,在IPTG(isoproptl-β-D-thiogalactoside)作用下低温16℃诱导12 h。经SDS-PAGE电泳分析得到与预测蛋白分子量相同的目标蛋白CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1,表达后的目的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。4.完成了南极衣藻叶绿素荧光特征分析。研究发现UVB、蓝光和极昼条件是可能影响极地环境中藻类的生理和代谢的胁迫条件;在UVB、蓝光和极昼条件下,南极衣藻***-L的最大光化学效率Fv/Fm随着胁迫时间的增加而逐渐下降,但非光化学猝灭NPQ却逐渐升高,这说明在UVB、蓝光和极昼条件下南极衣藻的PSⅡ反应中心发生了光抑制。结论:本研究克隆获得南极衣藻***-L隐花色素基因CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1,并进行初步生物信息学分析。通过在不同胁迫条件下探究南极衣藻***-L隐花色素基因的表达

关键词：南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L 隐花色素 Quantitative real-time PCR 原核表达叶绿素荧光参数

矮牵牛隐花色素基因PhCRY1、PhCRY2的克隆及功能研究

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矮牵牛隐花色素基因PhCRY1、PhCRY2的克隆及功能研究

作者：王雪娣安徽农业大学

学位级别：硕士

矮牵牛（Petunia ×hybrida）为茄科碧冬茄属观赏植物,同时也是重要的模式植物。近年来研究发现蓝光受体隐花色素（Cryptochrome,CRY）在植物的分枝发育具有重要作用。为研究PhCRY1、PhCRY2的功能,我们从Petunia × hybrida cv Mitchell... 详细信息

矮牵牛（Petunia ×hybrida）为茄科碧冬茄属观赏植物,同时也是重要的模式植物。近年来研究发现蓝光受体隐花色素（Cryptochrome,CRY）在植物的分枝发育具有重要作用。为研究PhCRY1、PhCRY2的功能,我们从Petunia × hybrida cv Mitchell Diploid中克隆了矮牵牛PhCRY1,PhCRY2的全长序列和PhCRY1启动子序列,并对PhCRY1和PhCRY2的蛋白序列进行了分析。利用qRT-PCR检测了PhCRY1、PhCRY2基因在不同组织、不同激素处理下的相对表达量。构建了 35S驱动的PhCRY1和PhCRY2的过表达载体,以及PhCRY1启动子融合GUS载体,并转化野生型拟南芥。构建了PhCRY1的病毒沉默载体,注射矮牵牛,分析了PhCRY1基因的功能。主要结果如下:（1）PhCRY1,PhCRY2的克隆及蛋白序列分析:PhCRY1含有一个长度为2043 bp的开放阅读框,编码680个氨基酸。序列分析发现PhCRY1蛋白含有DNA photolyase、FAD binding 7和Cryptochrome C等结构域;推测PhCRY1蛋白的相对分子量为77.1 KD,等电点5.47,蛋白分子式为(C3436H5232N962O1029S19。PhCR Y2则含有长度为1005 bp的开放阅读框,编码334个氨基酸。PhCRY2蛋白含有高度保守的DNA photolyase结构域,分子量37.7 KD,等电点8.10,蛋白分子式为C1709H2639N449O493S10;PhCRY1和PhCRY2蛋白均含有α-螺旋,延伸链,β-折叠和无规卷曲四种二级结构。（2）PhCRY1启动子的克隆及分析:获得全长为1669 bp的PhCRY1启动子序列,该序列除含有CAAT-box、TATA-box等特征元件外,还含有TGA-element生长素响应元件、四类光响应元件:AE-box、GT1-motif、I-box、TCCC-motif,干旱调控元件MBS,以及水杨酸调控元件TCA-element。（3）PhCRY1,PhCRY2表达特性分析:在不同组织中,PhCRY1基因的表达量为根＞叶＞茎＞叶腋＞花。根、叶与茎中表达量分别为花中的18、7和5倍;PhCRY2基因在不同组织中的相对表达量为:根＞叶腋＞茎＞花＞叶。根中的表达量约为花的6倍,而其他组织中表达差异较小。PhCRY1与PhCRY2在6-BA,GR24,IAA处理下均没有显著变化,表明PhCRY1、PhCRY2基因不受生长素、细胞分裂素以及独脚金内酯的调控。（4）PhCRY1、PhCRY2过表达载体构建及功能分析:构建了35::PhCRY1,35::PhCRY2过表达载体,以及pPhCRY1::GUS表达载体,侵染了拟南芥野生型,并筛选得到转基因植株。构建了pTR V2-PhCRY1载体并注射矮牵牛,结果显示矮牵牛PhCRY1沉默株系表现出分枝数目减少及早花现象。

关键词：矮牵牛分枝发育隐花色素 CRY1 CRY2 VIGS

大豆原生质体瞬时表达体系的建立及大豆隐花色素的亚细胞定位

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大豆原生质体瞬时表达体系的建立及大豆隐花色素的亚细胞定位

作者：熊璐吉林大学

学位级别：硕士

隐花色素是植物体内的一类重要的蓝光受体,能够介导光信号调控植物的去黄化、开花、避荫反应等多种生长发育过程。隐花色素在模式植物拟南芥中得到了较好的研究,而在大豆等主要作物中的研究较少。原生质体瞬时表达体系能够快速、高效地... 详细信息

隐花色素是植物体内的一类重要的蓝光受体,能够介导光信号调控植物的去黄化、开花、避荫反应等多种生长发育过程。隐花色素在模式植物拟南芥中得到了较好的研究,而在大豆等主要作物中的研究较少。原生质体瞬时表达体系能够快速、高效地实现目标蛋白的亚细胞定位分析。本文希望利用大豆原生质瞬时表达体系对大豆隐花色素在黑暗和蓝光下的亚细胞定位进行分析,为大豆隐花色素的功能预测提供信息。由于尚无大豆原生质体转化方法的报道,本文尝试利用酶解法裂解大豆叶片细胞壁获得了原生质体,并用PEG介导的方法成功将外源载体转入大豆叶片原生质体并表达。进一步对酶解液组成、PEG分子量、叶片时期、质粒浓度和转化时间等影响因素进行分析,确定了大豆叶片原生质体提取和转化的最佳条件,建立了高效的大豆叶片原生质体瞬时转化体系,转化效率达50%以上。通过该体系将大豆7个隐花色素(GmCRYs)转入大豆叶片原生质体并观察了其在黑暗和蓝光下的亚细胞定位情况。具体结果如下:1)最佳叶片时期:出土10天的真叶或刚展开的第一片三出复叶。2)最佳裂解酶成分:1.0%纤维素酶,0.2.4%果胶酶。3)最佳PEG分子量:4000。4)最佳质粒浓度:大于或等于1μg/μL。5)最佳转化时间:15分钟。6)大豆隐花色素的亚细胞定位:GmCRY1a、Gm CRY1b、GmCRY1c和GmCRY1d在黑暗下分布于细胞核和细胞质中,见蓝光后迅速在细胞质中形成类似光小体的结构。GmCRY2a、GmCRY2b和GmCRY2c持续定位在细胞核中,见蓝光后没有观察到明显的光小体结构形成。

关键词：大豆隐花色素原生质体亚细胞定位

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水稻隐花色素及其互作蛋白的功能初步研究

水稻隐花色素及其互作蛋白的功能初步研究

作者：于春生中国农业科学院

学位级别：硕士

隐花色素Cryptochromes(CRYs)是一类蓝光受体,在藻类、真菌、苔藓、蕨类、种子植物和动物中广泛存在。植物隐花色素参与调节光响应,如光形态建成、开花时间、生物钟、气孔开放和细胞凋亡等过程。在模式植物拟南芥中,隐花色素调节光响应... 详细信息

隐花色素Cryptochromes(CRYs)是一类蓝光受体,在藻类、真菌、苔藓、蕨类、种子植物和动物中广泛存在。植物隐花色素参与调节光响应,如光形态建成、开花时间、生物钟、气孔开放和细胞凋亡等过程。在模式植物拟南芥中,隐花色素调节光响应的机制已经有较深入的研究,但在水稻中的调节机制尚不清楚。本研究对水稻隐花素的功能和信号转导机制进行了初步探索,主要研究结果如下:(1)克隆了水稻中的三个隐花色素基因:OsCRY1a、OsCRY1b和OsCRY2。(2)利用酵母双杂技术证实OsBICs(blue-light independent interaction with Cryptochromes)蛋白能够与OsCRYs相互作用,其中:OsBIC1与OsCRY2的作用依赖于蓝光,OsBIC2在黑暗中也能与OsCRYs相互作用,且蓝光能促进其互作。(3)利用CRISP技术创制水稻隐花素及其互作蛋白编码基因的突变体。构建了OsCRYs、OsBICs、OsCIBs、OsSPAs、OsCOP1的CRISPR/Cas9载体并转化水稻,其中OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2和OsBIC1基因在T0和T1代转化材料中检测到了碱基缺失、增加或替换等突变;已获得纯合的Oscry1a、Oscry1b和Osbic1突变体,其它基因纯合突变体正在鉴定中。(4)苗期表型分析表明Oscry1a和Oscry1b突变材料在蓝光下均表现为显著的叶鞘伸长的表型,而Osbic1突变体植株变矮;开花表型正在鉴定中。(5)获得了OsBIC1和OsBIC2的过表达水稻材料。分别制备了特异识别OsBIC1和OsBIC2的抗体,并通过western blot证实OsBICs蛋白在过表达植株中获得高水平表达。表型观察发现,OsBICs过表达植株在自然条件下表现为抽穗延迟表型,这与前人已报道的OsCRYs过表达导致的水稻抽穗期提前表型相反。综合上述结果,OsBICs蛋白能够与OsCRYs蛋白互作,且OsBICs在苗期光形态建成和开花期调控方面均与OsCRYs呈现相反的功能,因此我们推测OsBICs主要是通过蛋白互作抑制OsCRYs介导的光信号转导。该研究为进步一步解析水稻隐花素介导的光信号转导机制提供了基础。

关键词：水稻隐花色素叶鞘伸长互作蛋白 CRISPR/CAS9

玉米隐花色素ZmCRY1b的克隆、转录丰度及功能探索

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玉米隐花色素ZmCRY1b的克隆、转录丰度及功能探索

作者：李红丹中国农业科学院

学位级别：硕士

玉米是世界上广泛种植的粮食和饲料作物之一,其株高、开花期、产量、品质等性状与环境中的光密切相关。植物的蓝光受体隐花色素能够调控动物和植物的生物钟节律,并促进植物体的光形态建成。因此,通过研究玉米隐花色素基因对不同光处理... 详细信息

玉米是世界上广泛种植的粮食和饲料作物之一,其株高、开花期、产量、品质等性状与环境中的光密切相关。植物的蓝光受体隐花色素能够调控动物和植物的生物钟节律,并促进植物体的光形态建成。因此,通过研究玉米隐花色素基因对不同光处理的表达模式,可为进一步研究其对玉米光形态建成的作用奠定基础。通过RT-PCR的技术克隆了ZmCRY1b和ZmCRY2基因;利用生物信息相关网站和软件对其编码的蛋白的结构域及氨基酸水平的系统发育进行了分析;利用qRT-PCR的方法分析了ZmCRY1b和ZmCRY2基因在玉米自交系B73的不同组织、响应不同光质及长日照和短日照处理下的转录丰度;构建ZmCRY1b过表达载体并转化拟南芥后得到了转基因植株在白光和蓝光下的表型。研究发现,ZmCRY1b和ZmCRY2蛋白与拟南芥、水稻和小麦的CRY蛋白的结构域相同,且其氨基酸序列的一致性也很高。暗示着它们有相似的功能。ZmCRY1b和ZmCRY2基因主要在玉米的叶片中表达;二者在各种持续光质中的表达丰度均高于黑暗条件下,且能迅速响应黑暗到各种光质的转换处理。但ZmCRY1b在持续光质、转换光质及长日照和短日照处理下的转录丰度均远高于ZmCRY2,说明ZmCRY1b能更有效地响应光质和光周期的处理。ZmCRY1b过表达植株在白光和蓝光下均呈现下胚轴缩短和子叶张开的表型。以上结果说明,ZmCRY1b和ZmCRY2基因均能有效地响应各种光质和光周期处理,并在玉米的光形态建成中发挥重要作用。本研究为进一步研究ZmCRY1b和ZmCRY2基因的功能及探讨二者在玉米品种改良的应用上提供理论基础,将会在作物重要农艺性状的定向改良中起到指导作用。

关键词：玉米隐花色素光形态建成光处理转录丰度

玉米隐花色素基因CRY1a的克隆及功能分析

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玉米隐花色素基因CRY1a的克隆及功能分析

作者：闫蕾山西大学

学位级别：硕士

玉米(Zea may)不但是重要的粮食作物,同时也是高光效的C4模式植物。隐花色素(cryptochrome,CRY)是高等植物主要的蓝光受体,与光形态建成、开花起始、种子休眠、生物产量等性状的发育密切相关。模式植物拟南芥的隐花色素研究已经较为深入... 详细信息

玉米(Zea may)不但是重要的粮食作物,同时也是高光效的C4模式植物。隐花色素(cryptochrome,CRY)是高等植物主要的蓝光受体,与光形态建成、开花起始、种子休眠、生物产量等性状的发育密切相关。模式植物拟南芥的隐花色素研究已经较为深入,在单子叶植物中除了对水稻、小麦、高粱、大麦的CRY1a进行研究外,玉米CRY1a一直未被研究。鉴于隐花色素参与调控植物生长发育的重要作用,开展对玉米隐花色素的研究迫在眉睫。本研究利用同源克隆的方法克隆、测序验证得到玉米B73两个ZmCRY1a基因的的编码区cDNA序列;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ZmCRY1a在不同器官、光质、光转换及长日照、短日照条件下的表达水平;利用相关生物信息学软件分析ZmCRY1as氨基酸序列及蛋白质功能结构域,并对ZmCRY1a和其他植物CRY1a蛋白的同源性进行分析。结果发现,ZmCRY1as与AtCRY1和OsCRY1a蛋白结构类似,包含1个DNA photolyase结构域、1个FAD binding 7结构域、1个Crytochrome C结构域;氨基酸序列同源性分析发现,ZmCRY1as与水稻OsCRY1a同源性最高,与拟南芥、大豆等双子叶植物的CRY1的同源性较低;ZmCRY1as在成株期叶片中表达量最高:ZwCRY1a1、ZmCRY1a2在叶中的表达量分别是其根中的52.1倍、15.3倍;相对于黑暗下,二者在各种持续光质中的表达丰度均较高,尤其蓝光和远红光条件下,分别达到黑暗中ZmCRY1a1表达量的9.5和9.0、6.3和8.3倍;尽管是作为编码蓝光受体的基因,ZmCRY1a1和ZmCRY1a2基因的表达却能强烈地响应远红光和红光刺激,其转录最大峰值分别达到各自黑暗时的4.8和3.9、22.8和14.5倍;同样二者也能响应光周期处理。长日照条件下,ZmCRY1a1与ZmCRY1a2的转录存在差异,表现为ZmCRY1a1的转录在一个光周期内共出现5个峰值,最高峰位于光照12 h,而ZwCRY1a2的转录只有4个峰值,最高峰位于进入黑暗2 h时;短日照条件下,两个ZmCRY1a的表达出现了极其相似的模式,均在进入黑暗后出现两个最高峰,分别位于一个光周期的第18 h和第22 h时,而在光照期间虽然有峰值出现,但峰值较低。同时把ZmCRY1a1和ZmCRY1a2基因构建到玉米过表达载体pBCXUN中,转化到农杆菌菌株GV3101,并侵染拟南芥,收获到T0代种子。得出的结论是:玉米ZmCRY1as与拟南芥AtCRY1a和水稻OsCRY1a具有相似的结构;ZmCRY1a在叶中表达量最高,并且能响应各种光质处理,特别是远红光;ZmCRY1as也能响应长日照和短日照条件处理。

关键词：玉米隐花色素光信号途径开花调控表达模式分析

拟南芥隐花色素CRY2调控ABA响应的表型鉴定及CRY2与ABI4相互关系的分析

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拟南芥隐花色素CRY2调控ABA响应的表型鉴定及CRY2与ABI4相互关系...

作者：沙志伟吉林大学

学位级别：硕士

光作为主要的环境因子在植物整个生长发育过程中都发挥重要的调控作用。植物感受环境光刺激主要是通过光受体来实现的,目前在拟南芥中已经鉴定出红光/远红光、蓝光/紫外光A(蓝光/UV-A)和紫外光B(UV-B)三类光受体,其中隐花色素(cryptochr... 详细信息

光作为主要的环境因子在植物整个生长发育过程中都发挥重要的调控作用。植物感受环境光刺激主要是通过光受体来实现的,目前在拟南芥中已经鉴定出红光/远红光、蓝光/紫外光A(蓝光/UV-A)和紫外光B(UV-B)三类光受体,其中隐花色素(cryptochromes,CRYs)作为一类重要的蓝光/UV-A受体,在促进光形态建成、调控光周期开花方面具有重要的功能,对其介导的蓝光信号转导机制的研究也较为深入。近年来,越来越多的试验证据表明CRYs参与调控植物对非生物胁迫的响应,包括对干旱、盐、高温和高光强辐射等的响应,然而其内在机制尚不清楚。本研究以拟南芥哥伦比亚野生型(Col4)、CRY2功能缺失突变体(cry2)和CRY2过表达的转基因拟南芥(pCAMBIA-35S::GFP-CRY2,以下简称GFP-CRY2)为材料,鉴定三种基因响应外源脱落酸(abscisic acid,ABA)诱导的表型,发现CRY2在ABA响应中发挥正向调控作用。通过体内和体外的蛋白质-蛋白质互作及蛋白质-DNA互作试验,发现CRY2与ABA信号转导途径中的一个重要转录因子ABI4(ABA INSENSITIVE 4,ABI4)发生相互作用。对CRY2过表达于ABI4功能缺失突变体的转基因拟南芥(GFP-CRY2/abi4)响应ABA的表型进行鉴定,发现CRY2对ABA响应的调控作用至少是依赖于ABI4的。具体研究结果如下:1.与Col4相比,cry2种子萌发和幼苗主根伸长对外源ABA的敏感性显著下降,而GFP-CRY2种子萌发对ABA的敏感性显著增加,说明CRY2正向调控ABA响应。2.利用酵母双杂交试验和双荧光互补试验(bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)证实CRY2与ABI4发生蓝光依赖的相互作用。3.通过酵母单杂交试验和双荧光素酶报告分析试验证实CRY2能够作用于ABI4基因的启动子(ATG上游2000bp的DNA序列),促进其转录活性。4.对GFP-CRY2/abi4转基因拟南芥T代纯合体在外源ABA诱导下的种子萌发率进行统计分析,发现其种子萌发率显著低于GFP-CRY2,但高于abi4,说明CRY2调控ABA响应至少是依赖于ABI4的,但还存在着其他的重要因子支持CRY2的功能。

关键词：隐花色素脱落酸 ABI4 信号转导