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基于种特异性COI引物（SS-COI）的桉树枝瘿姬小蜂A、B隐种快速鉴定技术

环境昆虫学报 2024年

作者：王瀚棠彭欣杨振德 .广西大学林学院广西森林生态与保育重点实验室广西高校亚热带人工林培育与利用重点实验室

隐种A和隐种B是桉树枝瘿姬小蜂Leptocybe invasa两种重要的全球入侵隐种，对多国林业生产造成了严重危害。由于桉树枝瘿姬小蜂体型微小，且无法从形态上区分隐种类型，给该害虫的防治造成困难。本研究基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I... 详细信息

隐种A和隐种B是桉树枝瘿姬小蜂Leptocybe invasa两种重要的全球入侵隐种，对多国林业生产造成了严重危害。由于桉树枝瘿姬小蜂体型微小，且无法从形态上区分隐种类型，给该害虫的防治造成困难。本研究基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I（mtDNA COI）基因序列的种特异性（species-specific COI，SS-COI）PCR方法，研究桉树枝瘿姬小蜂隐种快速分子检测技术。基于隐种A、B的COI序列分别设计特异性SS-COI引物各1对（AF / AR和BF / BR）。使用这两对引物扩增同一桉树枝瘿姬小蜂样品DNA，即可有效进行隐种鉴定，同时两对引物也能互相验证鉴定结果。引物鉴定灵敏性检测结果显示，AF / AR与BF / BR均具有较高的鉴定灵敏性，其对DNA的有效鉴定浓度阈值分别为11.42 pg/μL和28.32 pg/μL。本研究开发的桉树枝瘿姬小蜂隐种A、B的快速鉴定方法解决了桉树枝瘿姬小蜂入侵地区隐种鉴别的难题，极大缩短鉴定时间、降低鉴定费用，为进一步探究桉树枝瘿姬小蜂隐种A、B的生物学差异以及它们对不同抗性品种桉树的适应能力提供技术参考。

关键词：桉树枝瘿姬小蜂隐种鉴定种特异性COI引物快速鉴定分子检测

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入侵性致瘿害虫桉树枝瘿姬小蜂(膜翅目:姬小蜂科)EST-SSR开发及隐种鉴定

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林业科学 2021年第9期57卷 140-151页

作者：彭欣王瀚棠郭春晖杨振德周静王雪丁芷柔广西大学林学院南宁530001 广西森林生态与保育重点实验室南宁530001

【目的】对入侵性致瘿害虫桉树枝瘿姬小蜂(膜翅目:姬小蜂科)进行EST-SSR引物开发和隐种鉴定,为桉树枝瘿姬小蜂种群遗传学研究及其防治提供理论依据。【方法】采用Illumina HiSeqTM 2000测序平台对3个地理种群的桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫... 详细信息

【目的】对入侵性致瘿害虫桉树枝瘿姬小蜂(膜翅目:姬小蜂科)进行EST-SSR引物开发和隐种鉴定,为桉树枝瘿姬小蜂种群遗传学研究及其防治提供理论依据。【方法】采用Illumina HiSeqTM 2000测序平台对3个地理种群的桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫进行转录组测序,利用MISA和Primer Premier 3软件进行EST-SSR标记的搜索、挖掘和引物设计。选取400对EST-SSR引物,结合国外报道的14对多态性G-SSR引物,应用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效率,并用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证引物多态性。基于桉树枝瘿姬小蜂COI基因序列数据对我国14个地理种群320个桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫样本进行隐种鉴定。【结果】1)共获得277048525条clean reads,包括82.86 G个核苷酸,组装后得到44878个unigene,平均长度1082.76 bp,N50为1976 bp;利用MISA软件搜索到EST-SSR位点14190个,其中主要重复类型是单核苷酸重复(占总EST-SSR的69.63%),其次是二核苷酸重复和三核苷酸重复(分别占总EST-SSR的16.17%、13.51%)。2)400对EST-SSR引物中有205对引物可有效扩增出目的片段,扩增效率51.25%,国外报道的14对G-SSR引物均能扩增出目的片段;3)用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证SSR引物多态性,最终筛选出10对多态性良好的EST-SSR引物,国外报道的14对G-SSR引物中仅有LiSS2、LiSS5、LiSS13在我国桉树枝瘿姬小蜂样本中存在多态性;4)从我国14个桉树枝瘿姬小蜂地理种群中共获得320条605 bp的COI基因序列,基于桉树枝瘿姬小蜂COI基因序列构建的NJ系统发育树表明,我国仅存在A、B 2种类型的桉树枝瘿姬小蜂隐种,样本比例约为1∶2。【结论】筛选出10对适合我国桉树枝瘿姬小蜂种群遗传学研究的EST-SSR引物。我国存在A、B 2种类型的桉树枝瘿姬小蜂隐种,其中隐种A首次在我国发现,桉树枝瘿姬小蜂的隐种鉴定可为该害虫在生物防治中采用正确的生物型提供依据。

关键词：桉树枝瘿姬小蜂转录组测序 EST-SSR 隐种鉴定

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基于mtDNA COI与rDNA ITS1双基因的烟粉虱隐种鉴定及MED和MEAM1隐种种群遗传结构分析

基于mtDNA COI与rDNA ITS1双基因的烟粉虱隐种鉴定及MED和MEAM1隐...

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作者：陈苗苗中国农业科学院

学位级别：硕士

烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）,属半翅目Hemiptera,粉虱科Aleyrodidae,小粉虱属Bemisia,是世界性的重要农业害虫。烟粉虱是一个包含30多个隐种的物种复合体,其中MEAM1和MED隐种已广泛入侵我国除西藏、宁夏等少数省区外的其他各省... 详细信息

烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）,属半翅目Hemiptera,粉虱科Aleyrodidae,小粉虱属Bemisia,是世界性的重要农业害虫。烟粉虱是一个包含30多个隐种的物种复合体,其中MEAM1和MED隐种已广泛入侵我国除西藏、宁夏等少数省区外的其他各省（直辖市、自治区）,并在许多地区成功取代未造成重大危害的土著烟粉虱。本研究围绕烟粉虱隐种形态相似、难以快速有效区分的问题,采用双基因DNA序列测定以及系统发育分析的技术与方法,探讨mtDNA COI与rDNA ITS1标记技术用于烟粉虱隐种鉴定的可行性,并对烟粉虱MED隐种和MEAM1隐种的种群遗传结构进行了分析。具体研究结果如下:（1）mtDNA COI与rDNA ITS1双基因标记技术用于烟粉虱隐种鉴定的可行性研究。以我国常见的9个烟粉虱隐种为对象,遗传距离分析显示,以mtDNA COI序列为靶标时,隐种内平均遗传距离为0.0054,隐种间平均遗传距离为0.1502,隐种间遗传距离为隐种内遗传距离的27.8倍,而且隐种内遗传距离与隐种间遗传距离没有重叠区域;以rDNA ITS1序列为靶标时,隐种内平均遗传距离为0.0044,隐种间平均遗传距离为0.0328,隐种间遗传距离仅为隐种内遗传距离的7.5倍,隐种内与隐种间遗传距离存在重叠现象。系统发育分析显示,以mtDNA COI序列为靶标时,无论是NJ树还是ML树,9个烟粉虱隐种均分别形成独立的进化分支。当以rDNA ITS1序列为靶标时,无论是NJ树还是ML树,9个烟粉虱隐种中仅有Asia II 3与Asia I可以形成独立的进化分支;而MED与MEAM1聚为一支,China 1与China 2聚为一支,Asia II 1,Asia II 6与Asia II 7聚为一支。结果表明,mtDNA COI基因更适用于烟粉虱隐种的鉴定。将本研究获得的以及整合GenBank数据库中所得到的高质量的COI序列（13种647条）和ITS1序列（12种636条）,共计14种1283条一并录入中国外来入侵物种数据库,为烟粉虱的远程识别提供技术支持和平台。（2）烟粉虱MED隐种种群遗传结构研究。从我国17个省（直辖市、自治区）48个区（县）采集烟粉虱标本,其中14个省（直辖市、自治区）33个区（县）有烟粉虱MED隐种,以此33个地理种群为靶标,采用双基因标记技术对其进行种群遗传结构分析。结果显示,COI基因总群体单倍型多样性Hd为0.599,核苷酸多样性π为0.00170;ITS1基因总群体单倍型多样性Hd为0.520,核苷酸多样性π为0.00129,表明烟粉虱MED隐种的遗传多样性处于中等水平。COI基因总群体Fu’s Fs检验结果为-21.031＜0,ITS1基因总群体Fu’s Fs检验结果为-4.701＜0,表明MED隐种在过去较近历史时期内经历了种群扩张事件。基于COI基因计算的总体固定系数Fst为0.16204＞0.15,总体基因流Nm为1.29＞1,表明MED群体之间发生中度遗传分化,基因交流水平较高;基于ITS1基因计算的总体固定系数Fst为0.02628＜0.05,总体基因流Nm为9.26＞4,表明MED群体之间几乎没有发生遗传分化,基因交流频繁,种群间可能存在交配现象。对MED隐种COI基因及ITS1基因进行分子方差分析,以及对单倍型之间的系统进化关系进行分析,认为地理隔离并不是造成我国烟粉虱MED隐种种群之间出现遗传分化的主导因素。将本研究获得的MED隐种单倍型序列与数据库中不同国家和地区的单倍型序列进行整合,构建系统发育树,推测我国的烟粉虱MED隐种有可能来源于美洲、非洲、地中海沿岸地区、欧洲西部和西北部等地区。（3）烟粉虱MEAM1隐种种群遗传结构研究。从我国17个省（直辖市、自治区）48个区（县）采集烟粉虱标本,其中7个省（直辖市、自治区）13个区（县）有烟粉虱MEAM1隐种,以此13个地理种群为靶标,采用双基因标记技术对其进行种群遗传结构分析。结果显示,COI基因总群体单倍型多样性Hd为0.414,核苷酸多样性π为0.00063;ITS1基因总群体单倍型多样性Hd为0.166,核苷酸多样性π为0.00168,表明烟粉虱MEAM1隐种的遗传多样性较低,不利于其种群的发展。COI基因总群体Fu’s Fs检验结果为-6.422＜0,ITS1基因总群体Fu’s Fs检验结果为-1.694＜0,表明MEAM1隐种在过去较近历史时期内经历了种群扩张事件。基于COI基因计算的总体固定系数Fst为0.58990,总体基因流Nm为0.17,表明MEAM1隐种种群可能因遗传漂变发生了遗传分化;基于ITS1基因计算的总体固定系数Fst为0.01037,总体基因流Nm为23.86,表明MEAM1隐种的种群遗传分化很小,基因交流水平较高。对MEAM1隐种COI基因及ITS1基因进行分子方差分析,以及对单倍型之间的

关键词：烟粉虱 mtDNA COI rDNA ITS1 隐种鉴定地理种群遗传结构

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烟粉虱Q与B隐种mtCOI基因的遗传变异及其对利用CAPS标记进行隐种鉴别的影响

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昆虫学报 2014年第10期57卷 1238-1244页

作者：刘国霞高长生付海滨褚栋山东省农业科学院生物技术研究中心山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室济南250100 青岛农业大学农学与植物保护学院山东青岛266109 沈阳出入境检验检疫局沈阳110016

【目的】为了评估Vsp I,Sty I和Stu I为基础的线粒体细胞色素氧化酶I基因(mt COI)酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)标记方法鉴别烟粉虱Q与B隐种的有效性。【方法】本研究对国内外烟粉虱种群的mt COI基... 详细信息

【目的】为了评估Vsp I,Sty I和Stu I为基础的线粒体细胞色素氧化酶I基因(mt COI)酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)标记方法鉴别烟粉虱Q与B隐种的有效性。【方法】本研究对国内外烟粉虱种群的mt COI基因进行了测序并鉴定了其隐种;在对464个Q隐种、98个B隐种mt COI序列分析的基础上,利用Vsp I,Sty I和Stu I对Q与B隐种分别进行了CAPS标记验证。检索并比对了Gen Bank中烟粉虱Q与B隐种mt COI序列中Vsp I,Sty I和Stu I酶切位点分布情况。【结果】对国内外烟粉虱种群研究发现,以Vsp I为基础的CAPS标记方法能够有效鉴别实验中的Q与B隐种;利用Stu I或Sty I的CAPS标记方法无法有效鉴别Q与B隐种。对Gen Bank中烟粉虱Q与B隐种mt COI序列比对发现,利用Vsp I,Sty I和Stu I为基础的CAPS标记方法不能有效鉴别Q与B隐种。【结论】以Vsp I,Sty I和Stu I为基础的CAPS标记方法鉴别Q与B隐种方面均有一定的局限性。

关键词：烟粉虱隐种 mtCOI基因酶切扩增多态性序列(CAPS) 隐种鉴定

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