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刚地弓形虫慢性感染小鼠脑组织中lncRNA102796的差异表达及其作用机制

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2022年第2期40卷 187-193页

作者：王振勋熊思思孙夏慧王永亮潘格何深一丛华山东大学齐鲁医学院基础医学院病原生物系济南250012

目的了解长链非编码RNA102796(lncRNA102796)在刚地弓形虫慢性感染小鼠脑组织中的差异表达及其作用机制。方法取SPF级雌性BALB/c小鼠构建弓形虫慢性感染小鼠模型。感染后2个月,取感染小鼠(10只)和健康对照小鼠(10只)脑组织,提取总RNA以... 详细信息

目的了解长链非编码RNA102796(lncRNA102796)在刚地弓形虫慢性感染小鼠脑组织中的差异表达及其作用机制。方法取SPF级雌性BALB/c小鼠构建弓形虫慢性感染小鼠模型。感染后2个月,取感染小鼠(10只)和健康对照小鼠(10只)脑组织,提取总RNA以及神经细胞的细胞质和细胞核RNA,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测小鼠脑组织中lncRNA102796的表达和在神经细胞中的定位。生物信息学分析预测lncRNA102796的靶基因为阿片受体1(opioid receptor delta 1,oprd1)基因。取感染小鼠和健康对照小鼠脑组织,提取总RNA和细胞蛋白,qRT-PCR检测脑组织中oprd1 mRNA相对转录水平,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测脑组织中OPRD1的表达情况。构建lncRNA102796的干扰质粒(干扰lncRNA102796)和过表达质粒(过表达lncRNA102796),分别以未干扰lncRNA102796的质粒pGPU6/GFP/Neo和未过表达lncRNA102796的质粒pcDNA3.1+为干扰对照和过表达对照。将质粒转染至神经小胶质细胞(BV-2),提取细胞内RNA,qRT-PCR检测lncRNA102796的干扰和过表达对oprd1 mRNA相对转录水平的影响;提取蛋白质,Western blotting检测lncRNA102796的干扰和过表达对OPRD1表达的影响。取干扰和过表达质粒及2种对照质粒转染后的BV-2细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测lncRNA102796对细胞增殖的调节作用。构建过表达正义和过表达反义lncRNA102796质粒,提取2种质粒转染的BV-2细胞的RNA和蛋白质,RNA-蛋白沉降(RNA pull down)和Western blotting分析与lncRNA102796结合的蛋白。结果qRT-PCR检测结果显示,弓形虫慢性感染小鼠脑组织中lncRNA102796相对转录水平为0.303±0.054,较健康小鼠下调(69.7±6.7)%(t=18.12,P102796在细胞核内的表达[(85.04±9.41)%]高于细胞质[(14.95±9.41)%](t=7.45,P1 mRNA相对转录水平为0.170±0.040,较健康对照小鼠下调了(83.0±5.3)%(t=27.17,P1蛋白表达量较健康对照小鼠减少。干扰lncRNA102796后,lncRNA102796相对转录水平为0.311±0.054,较对照组下调了(68.9±6.6)%(t=18.00,P1 mRNA相对转录水平为0.175±0.040,较对照组下调(82.5±5.1)%(t=28.08,P1蛋白的表达量较对照组减少;过表达lncRNA102796后,lncRNA102796相对转录水平为8.220±1.192,较对照组上调(722.0±146.0)%(t=8.56,P1 mRNA相对转录水平为2.533±0.365,较对照组上调(153.3±44.7)%(t=5.95,P1蛋白表达量较对照组增加。CCK-8实验结果显示,干扰lncRNA102796可抑制神经小胶质细胞的增殖,培养48和72 h后,A450值分别为0.272±0.021、0.508±0.014,低于对照组的0.473±0.024、0.816±0.014(t=6.35、46.77,P102796可促进小胶质细胞的增殖,培养48、72 h后,A450值分别为0.621±0.038、1.026±0.114,高于对照组的0.365±0.010、0.530±0.147(t=10.55、5.17,P1可以与lncRNA102796结合。结论在弓形虫慢性感染的小鼠脑组织中,lncRNA102796通过与靶基因oprd1结合抑制小胶质细胞的增殖,影响细胞周期,从而导致神经细胞的损伤。

关键词：刚地弓形虫长链非编码RNA102796 神经胶质细胞阿片受体δ1

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