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重组人E1A激活基因阻遏子/myc-His融合糖蛋白的纯化及功能鉴定

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中国应用生理学杂志 2010年第3期26卷 297-301,I0003页

作者：孙鸣宇韩雅玲郭鹏康建闫承慧沈阳军区总医院全军心血管病研究所心内科辽宁沈阳110016

目的:纯化重组人E1A激活基因阻遏子(hCREG)糖蛋白,验证重组hCREG糖蛋白具有抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)增殖的生物学功能。方法:根据6×His亲和层析原理,应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白,纯化后蛋白通过HiTrap脱盐柱... 详细信息

目的:纯化重组人E1A激活基因阻遏子(hCREG)糖蛋白,验证重组hCREG糖蛋白具有抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)增殖的生物学功能。方法:根据6×His亲和层析原理,应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白,纯化后蛋白通过HiTrap脱盐柱脱盐。用流式细胞周期分析研究添加0.5μg/ml、1μg/ml及2μg/ml重组hCREG/myc-His融合糖蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。用BrdU掺入方法研究重组蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。结果:根据6×His亲和层析原理用Ni-NTA纯化重组hCREG蛋白,浓缩并脱盐后的重组hCREG蛋白浓度为1.6mg/ml,纯度为92%,此蛋白仍保留了糖基化形式。流式细胞仪细胞周期分析结果提示重组hCREG蛋白可抑制体外培养的HITASY细胞增殖,且低浓度组的抑制效应要高于高浓度组。BrdU掺入实验结果提示,添加2μg/ml重组hCREG蛋白组与对照组相比可显著抑制体外培养的HITASY细胞增殖,组间比较有统计学差异(P<0.05)。结论:具有生物学功能的重组hCREG/myc-His糖蛋白的成功纯化,为hCREG蛋白的功能研究及生物工程制备提供了实验平台。

关键词：腺病毒E1A蛋白(E1A) 阻遏子糖蛋白蛋白纯化

人E1A激活基因阻遏子的表达、抗体制备及生物学活性分析

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第5期21卷 570-574页

作者：韩雅玲刘海伟闫承慧康建王效增胡叶沈阳军区总医院心血管内科心血管病研究所辽宁沈阳110016

目的:构建人E1A激活基因阻遏子(humancellularrepressorofE1A-stimulatedgene,hCREG)基因的原核表达载体,纯化重组的hCREG融合蛋白并制备兔抗hCREG抗体。探讨hCREG蛋白在人血管平滑肌细胞克隆株(HITASY)中的表达、定位。方法:用PCR技术... 详细信息

目的:构建人E1A激活基因阻遏子(humancellularrepressorofE1A-stimulatedgene,hCREG)基因的原核表达载体,纯化重组的hCREG融合蛋白并制备兔抗hCREG抗体。探讨hCREG蛋白在人血管平滑肌细胞克隆株(HITASY)中的表达、定位。方法:用PCR技术,扩增hCREG并构建pGEX-4T-1/hCREG原核表达载体。诱导表达重组谷胱甘肽巯基转移酶(glutathioneS-transferase,GST)-hCREG融合蛋白。以GST-hCREG为抗原,制备兔抗人GST-hCREG的抗血清,并通过蛋白A和GST亲和层析纯化。用ELISA和Westernblot法检测抗体的效价和特异性;用免疫荧光染色法检查去血清培养前后HITASY细胞中hCREG蛋白的表达及定位;用BrdU染色观察分泌型hCREG蛋白对HITASY细胞增殖的影响。结果:经鉴定证实构建的重组质粒正确。诱导后pGEX-4T-1/hCREG菌株可表达大量的GST-hCREG融合蛋白,层析纯化后其纯度达90%。Westernblot检测表明,纯化的兔抗hCREG抗体可与hCREG蛋白特异性结合。ELISA测得该抗体的效价>1∶105。免疫荧光染色检测显示,去血清培养诱导的HITA-SY细胞中hCREG蛋白的表达增加且定位在核周围。BrdU染色表明,hCREG可明显抑制HITASY细胞增殖。结论:成功地获得兔抗hCREG抗体。证实去血清培养的血管平滑肌细胞中CREG蛋白的表达上调。表达的hCREG蛋白可抑制HI-TASY细胞增殖,提示hCREG可能参与调控血管平滑肌细胞的增殖与分化。

关键词：腺病毒E1A蛋白(E1A) 阻遏子纯化抗体增殖血管平滑肌细胞

E1A激活基因阻遏子蛋白与细胞膜受体IGF2R(11～13)结构域作用抑制人血管平滑肌细胞迁移

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中国动脉硬化杂志 2012年第11期20卷 961-967页

作者：闫承慧孙鸣宇张效林徐凯李毅王效增韩雅玲解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所辽宁省沈阳市110840

目的研究人E1A激活基因阻遏子基因(CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞迁移中的作用。方法构建含有myc和His标签的野生型CREG(wtCREG)和去糖基化突变型CREG(mCREG)真核表达载体pcDNA3.1myc-His/wt/mCREG。转染人293F细胞株,Ni-NTA亲合层析方... 详细信息

目的研究人E1A激活基因阻遏子基因(CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞迁移中的作用。方法构建含有myc和His标签的野生型CREG(wtCREG)和去糖基化突变型CREG(mCREG)真核表达载体pcDNA3.1myc-His/wt/mCREG。转染人293F细胞株,Ni-NTA亲合层析方法纯化获得wtCREG和mCREG蛋白;将重组wt-CREG(400 nmol/L)及mCREG蛋白(400 nmol/L),分别加入体外培养的低表达CREG的人血管平滑肌细胞OB2中,应用Western blot、细胞刮伤实验、明胶酶电泳方法观察两种重组人CREG蛋白对人血管平滑肌细胞迁移和分化等生物学行为的影响;通过不同浓度(2、4、8 mg/L)的胰岛素生长因子2受体(M6P/IGF2R)中和抗体与人M6P/IGF2R细胞外结构域蛋白小肽分别进行阻断实验,分析M6P/IGF2R是否参与介导CREG蛋白对平滑肌细胞迁移的调控。结果刮伤实验发现,加入最佳效应浓度的wtCREG和mCREG蛋白24 h后,OB2组细胞的迁移能力均明显下降;明胶酶电泳和Western blot检测结果也证实,两种重组CREG蛋白均可以使细胞外基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的合成及活性减少,而组织金属蛋白酶抑制物表达则明显增加;同时,Western blot分析也证实,平滑肌细胞分化标志蛋白myocardin、SMα-actin、肌球蛋白重链和caldesmin表达增加,LM-1和FN表达减少。提示两种重组CREG蛋白均能够抑制体外培养的人血管平滑肌细胞迁移,促进其分化。IGF2R中和抗体和IGF2R小肽阻断实验证实:不同浓度的Anti-M6P/IGF2R能有效阻断两种CREG蛋白对人血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质合成的调控作用。并且,M6P/IGF2R的第11～13结构域小肽片段对wt/mCREG蛋白的生物学效应也有明显的阻断作用。结论重组CREG蛋白可能通过细胞膜表面M6P/IGF2R的11～13结构域抑制人血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质分泌,维持细胞分化。

关键词： E1A蛋白阻遏子平滑肌细胞迁移

E1A激活基因阻遏子调控体外培养人VSMCs表型转换的机制研究

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E1A激活基因阻遏子调控体外培养人VSMCs表型转换的机制研究

作者：胡叶大连医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖与迁移是导致动脉粥样硬化和血运重建后再狭窄等血管狭窄性损伤形成的重要原因。而血管损伤后 VSMCs 由分化表型转变为去分化表型的过程是细胞增殖和迁移的始动... 详细信息

研究背景和目的:血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖与迁移是导致动脉粥样硬化和血运重建后再狭窄等血管狭窄性损伤形成的重要原因。而血管损伤后 VSMCs 由分化表型转变为去分化表型的过程是细胞增殖和迁移的始动因素,也是增生性血管疾病的共同病理基础。E1A 激活基因阻遏子(cellular repressor ofE1A-stimulated genes, CREG)是新近从 Hela 细胞 cDNA 文库中克隆的转录调控相关基因。研究表明,CREG 蛋白与 6-磷酸甘露醇胰岛素样生长因子Ⅱ受体(insulin-like growth factorⅡ/mannose 6-phosphatereceptor,M6P/IGF2R)相关,在多种肿瘤细胞中发挥抑制增殖和促进分化的作用。先前报道本室建立的人胸廓内动脉 VSMCs 克隆株HITASY 在不同培养条件下可发生分化和去分化表型的相互逆转,应用差异显示 PCR 技术在分化表型 HITASY 中筛选到高表达差异性 CREG基因,提示其表达可能与 VSMCs 分化密切相关。我们先前的研究发现,CREG 基因能够诱导体外培养的大鼠 VSMCs SM α-actin 表达并促进细胞向分化表型转换。大鼠颈动脉拉伤实验亦证实,CREG 蛋白表达与血管损伤后再狭窄过程中 VSMCs 增殖能力呈负相关。这些提示 CREG基因具有促进分化、抑制增殖等促进 VSMCs 向分化表型转换的功能,但 CREG 基因在这一过程中的作用机制及该基因对 VSMCs 迁移的影响迄今尚未见报道。·2·丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶,由 3 个成员组成,即细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated protein kinase,ERK),应激活化蛋白激酶 JNK 和蛋白激酶 P38。MAPK 介导的信号转导途径是细胞内多种增殖、分化、迁移等信息传递的共同通路,是细胞外信号引起细胞核反应的会聚点。活化的 MAPK 通过转位进入胞核内,激活多种早期反应的核内癌基因,如 fos、myc、jun 等,启动和促进与细胞增殖、分化有关的蛋白质基因的转录和表达,引起细胞增殖、促进蛋白质和胶原的合成等。最近有研究报道 CREG 蛋白可以作为 ERK 信号转导途径抑制剂抑制心肌细胞增殖。本实验的目的是探讨 CREG 蛋白对 VSMCs 增殖和迁移活性的影响及其作用机制。实验方法:(1)构建载体:用亚克隆技术将 pGEX-4T-1(+)/CREG中的CREG cDNA 经pVAX1质粒正向克隆至逆转录病毒载体pLNCX2;同时,将 CREG cDNA 反向克隆至逆转录病毒载体 pLXSN,分别构建正义 CREG 载体 pLNCX2( + )/CREG 和反义 CREG 载体pLXSN(-)/CREG,筛选阳性克隆送 TaKaRa 公司测序。(2)以带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的空载体 pLNCX(+)/GFP 为对照,用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体感染 293 细胞,包装出完整的逆转录病毒后,感染 HITASY。经 G418 筛选,获得稳定感染的细胞克隆。(3)应用免疫荧光染色、Western blot 等方法检测感染pLNCX2(+)/CREG 和 pLXSN(-)/CREG 后 HITASY 细胞 CREG 和平滑肌分化标志蛋白 α-肌动蛋白(SM α-actin)表达,以探讨 CREG 对HITASY 分化的影响(。4)应用 BrdU 染色的方法检测感染前后 HITASY细胞增殖能力的改变,并通过 Western blot 等方法检测 ERK/MAPK 信号转导通路的改变以探讨 CREG 对 HITASY 细胞增殖的影响及其作用机制。(5)通过刮伤实验、慢速显微摄像技术观察感染前后 HITASY的迁移能力,用明胶酶谱方法分析细胞基质金属蛋白酶(matrix

关键词：阻遏子腺病毒蛋白E1A 分化增殖迁移平滑肌

重组人E1A激活基因阻遏子/myc-His融合糖蛋白的表达纯化及功能鉴定

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重组人E1A激活基因阻遏子/myc-His融合糖蛋白的表达纯化及功能鉴定

作者：孙鸣宇第四军医大学

学位级别：硕士

目的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)是1998年Gill博士利用酵母双杂交技术克隆的一个转录调控相关因子。CREG基因可与外源性腺病毒蛋白E1A及哺乳动物体内转录因子E2F家族蛋白竞争性地结合在靶基... 详细信息

目的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)是1998年Gill博士利用酵母双杂交技术克隆的一个转录调控相关因子。CREG基因可与外源性腺病毒蛋白E1A及哺乳动物体内转录因子E2F家族蛋白竞争性地结合在靶基因的启动子区,从而阻遏E1A蛋白和E2F对靶基因的转录,而E1A、E2F均具有促进细胞增殖的作用,所以CREG可能通过与E1A、E2F竞争性抑制作用而起到促进细胞分化、抑制细胞增殖的作用。本实验室前期研究发现,去血清能够诱导体外培养的人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)从合成表型逆转为分化表型,同时CREG蛋白表达明显增加。大鼠颈动脉拉伤实验证实,CREG基因表达与VSMCs增殖能力呈负相关,推测其可能参与了VSMCs表型调控。Veal博士等证实CREG是一种分泌型糖蛋白,可以与胰岛素样生长因子II竞争性结合细胞膜胰岛素样生长因子受体II,以自分泌和旁分泌两种途径对细胞功能进行调控。为进一步明确CREG糖蛋白的功能,本研究采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白印迹(Western blot)及Ni-NTA亲和层析等方法表达、纯化重组hCREG糖蛋白,并用流式细胞周期分析、5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入实验等方法验证重组人CREG(hCREG)糖蛋白具备抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞(Human internal thoracic artery-Shenyang, HITASY)增殖的生物学功能,为hCREG蛋白的工程化生产提供前期研究基础。方法①用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框并构建pcDNA3.1 myc-His/hCREG真核表达载体。②Lipofectamine 2000转染人293F细胞株并筛选稳定表达细胞克隆,Western blot方法鉴定hCREG/myc-His融合蛋白的表达,糖苷酶法及Western blotting行hCREG/myc-His融合蛋白的糖基化分析。③根据6×His亲和层析原理,应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白,纯化后蛋白通过HiTrap脱盐柱脱盐。④用流式细胞周期分析研究添加0.5μg /mL、1μg /mL及2μg /mL重组hCREG/myc-His融合糖蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。用BrdU掺入方法研究添加重组蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。结果RT-PCR扩增含终止密码突变的hCREG cDNA片段,经BamH I和EcoR I双酶切构建了pcDNA 3.1myc-His/hCREG真核表达载体,酶切及测序结果均证实构建的重组质粒正确。稳定表达pcDNA 3.1 myc-His/hCREG的293F细胞及未转染的对照细胞裂解产物,分别以Anti-hCREG、Anti-myc及Anti-His行Western blot检测。hCREG抗体可检测到转染组较对照组多两条约30KD的融合蛋白表达条带,myc抗体及His抗体均检测到大小约为30KD的融合蛋白表达。将稳定表达pcDNA 3.1 myc-His/hCREG的293F细胞裂解产物及经PNGaseF处理过的样品分别行Anti-hCREG、Anti-myc及Anti-His的Western blot检测。结果显示经PNGaseF处理后,hCREG融合蛋白分子量由30KD降低至25KD,电泳条带下移,证明带有myc和His标签的重组hCREG蛋白为糖基化蛋白。根据6×His与Ni亲合层析的原理用Ni-NTA纯化hCREG重组蛋白。收集的洗脱液经Centriprep离心超滤管(10000NMWL)浓缩后,经BCA法测定并与蛋白标准曲线比较,重组hCREG蛋白浓度为1.6 mg/mL。考马斯亮兰染色可见30KD大小的较单一条带,经image-J软件分析,纯度为92%。浓缩并脱盐后的纯化蛋白经PNGaseF处理后分子量由30KD降至25KD,条带下移,证实纯化后的蛋白仍保留了糖基化形式。流式细胞仪细胞周期分析结果提示重组hCREG蛋白与对照组相比可抑制体外培养的HITASY细胞增殖,G0/G1期细胞比率(共计数2万个细胞)显著增加,且低浓度组的抑制效应要高于高浓度组。BrdU掺入实验结果提示,添加2μg /mL重组hCREG蛋白组与对照组相比可显著抑制体外培养的HITASY细胞增殖,BrdU阳性细胞的比率降低。组间比较有统计学差异(P<0.05)。结论pcDNA 3.1 myc-His/hCREG真核表达载体的构建及具有生物学功能的重组hCREG/myc-His糖蛋白的表达纯化,为hCREG蛋白的功能研究及生物工程制备提供了实验平

关键词：腺病毒E1A蛋白(E1A) 阻遏子糖蛋白表达纯化

E1A激活基因阻遏子在不同表型血管平滑肌细胞中的表达

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沈阳部队医药 2005年第3期18卷 147-151页

作者：刘海伟韩雅玲康建阎承慧王效增沈阳军区总医院心血管内科 110016

为探讨血管平滑肌细胞表型转换、分化过程中E1A激活基因阻遏子(CREG)的表达变化及其相关机制,采用PCR扩增的CREG片段插入pGEX-4T-1原核表达载体,纯化的CREG融合蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体;以人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)为模型,[... 详细信息

为探讨血管平滑肌细胞表型转换、分化过程中E1A激活基因阻遏子(CREG)的表达变化及其相关机制,采用PCR扩增的CREG片段插入pGEX-4T-1原核表达载体,纯化的CREG融合蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体;以人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)为模型,[3H]标记脱氧胸苷掺入法测定去血清培养HITASY 细胞DNA合成变化;Western blot观察HITASY细胞在去血清培养过程中SM α-actin、calponin的表达,RT—PCR 和Western blot分析去血清培养诱导CREG mRNA和蛋白表达变化;免疫组化观察CREG在细胞内的表达及定位。结果成功地构建了载体并得到抗CREG多克隆抗体。去血清培养可使HITASY细胞DNA合成明显降低。随去血清培养时间延长,除SM α-actin和calponin表达逐渐上调之外,CREC mRNA转录活性和蛋白翻译合成亦上调。免疫组化显示去血清培养后,CREG蛋白在细胞内表达并主要位于细胞核周。结论:去血清能促使 HITASY细胞由合成表型向收缩表型转换,同时伴CREG mRNA和蛋白表达上调。

关键词：阻遏子血管平滑肌细胞表达腺病毒E1A蛋白多克隆抗体

肝细胞E1A激活基因阻遏子通过转化生长因子激酶1依赖减轻小鼠肝缺血再灌注损伤

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临床肝胆病杂志 2019年第5期35卷 1134-1134页

作者： Yang L 王玮珺华中科技大学同济医学院附属协和医院

【据《Hepatology》2019年1月】报道:肝细胞E1A激活基因阻遏子通过转化生长因子激酶1依赖减轻小鼠肝缺血再灌注损伤(作者 Yang L等)肝缺血再灌注损伤是在肝移植、肝切除手术中不可避免的损伤过程,是肝脏外科手术的一大难题。目前唯一有... 详细信息

【据《Hepatology》2019年1月】报道:肝细胞E1A激活基因阻遏子通过转化生长因子激酶1依赖减轻小鼠肝缺血再灌注损伤(作者 Yang L等)肝缺血再灌注损伤是在肝移植、肝切除手术中不可避免的损伤过程,是肝脏外科手术的一大难题。目前唯一有效的治疗方案是缺血预处理,但在适应症上存在缺陷。因此,对肝缺血再灌注损伤发病机制的深入了解并开发有效的治疗方法至关重要。E1A激活基因阻遏子(CREG)是细胞增殖的关键调节因子,已有相关文献报道其在心血管疾病中发挥重要的保护作用,同时也可在肝脂质积累和炎症反应中发挥保护作用。然而,其在肝缺血再灌注损伤中的作用尚未见报道。因此,探讨CREG在肝缺血再灌注损伤中的作用可为临床诊疗提供新的思路。

关键词：肝缺血再灌注损伤转化生长因子阻遏子 E1A 肝细胞基因激活小鼠

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单分子水平的酶催化与基因表达研究

物理化学学报 2010年第7期26卷 1976-1987页

作者：苏晓东金坚石谢晓亮北京大学生物动态光学成像中心(BIOPIC) 北京100871 北京大学生命科学学院北京100871 北京大学前沿交叉学科研究院北京100871 Department of Chemistry and Chemical Biology Harvard University

近半个多世纪以来生命科学取得了非凡的进展,从DNA双螺旋结构的提出,到第一个酶晶体结构的被解析,都得益于像X射线衍射、核磁共振、质谱这样的物理化学工具的发展.如今,在深入细致地定量研究生物活体系统中我们正面临新的挑战,例如:了... 详细信息

近半个多世纪以来生命科学取得了非凡的进展,从DNA双螺旋结构的提出,到第一个酶晶体结构的被解析,都得益于像X射线衍射、核磁共振、质谱这样的物理化学工具的发展.如今,在深入细致地定量研究生物活体系统中我们正面临新的挑战,例如:了解酶及其他大分子复合物在体内是如何实时工作的,它们在分子数很少时是怎样工作的,在活细胞中大分子复合物是如何协调工作的,以及不同的基因在活细胞中分子数很少的情况下是如何实现表达和不表达的等等.近十多年来,单分子成像,超高分辨率显微镜和单分子操纵技术在世界范围内被广泛地运用于生物医学研究,对生物化学和分子生物学的发展产生着深远的影响,因为运用这些单分子、超高分辨技术,使很多如上述的令人感兴趣的生物学问题实现了单分子层面上的研究和理解.本文拟就近年来相关的物理化学方法特别是单分子方法和技术在生物医学中的应用做一个简要介绍.

关键词：单分子酶学米氏方程荧光蛋白乳糖操纵子基因表达阻遏子

重组分泌型人CREG/myc-His融合糖蛋白的表达及功能分析

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中国免疫学杂志 2008年第8期24卷 685-688页

作者：韩雅玲孙鸣宇郭亮郭鹏栾波康建闫承慧沈阳军区总医院全军心血管病研究所沈阳110016

目的:构建人E1A激活基因阻遏子(Human cellular repressor of E1A-stimulated gene,hCREG)基因的真核表达载体并转染人293F细胞株,筛选稳定转染细胞克隆,鉴定重组的分泌型hCREG/myc-His融合蛋白的糖基修饰和生物学功能。方法:用RT-PCR... 详细信息

目的:构建人E1A激活基因阻遏子(Human cellular repressor of E1A-stimulated gene,hCREG)基因的真核表达载体并转染人293F细胞株,筛选稳定转染细胞克隆,鉴定重组的分泌型hCREG/myc-His融合蛋白的糖基修饰和生物学功能。方法:用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框并构建pcDNA4 myc-His/hCREG真核表达载体;Lipofectamine 2 000转染人293F细胞株并筛选稳定表达细胞克隆,去血清法诱导重组蛋白表达;应用Western blot方法鉴定分泌型hCREG/myc-His融合蛋白的表达,糖苷酶法及Western blot行hCREG/myc-His融合蛋白的糖基化分析;用流式细胞周期分析分泌型hCREG/myc-His融合蛋白对体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)增殖能力的影响。结果:RT-PCR扩增含终止密码突变的hCREGcDNA片段,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切构建了pcDNA4 myc-His/hCREG真核表达载体,酶切及测序结果证实构建的重组质粒正确;Western blot证实转染pcDNA4 myc-His/hCREG的293F细胞克隆可以稳定表达并分泌hCREG/myc-His融合蛋白;糖苷酶分析证实分泌型hCREG/myc-His融合蛋白是糖基化蛋白;流式细胞周期分析证实与正常培养HITASY细胞比较,添加含有分泌型hCREG/myc-His糖蛋白上清的HITASY细胞出现明显的G1期细胞周期阻滞现象(58.88%vs 62.89%,P<0.005)。结论:构建了pcDNA4 myc-His/hCREG真核表达载体并表达了具有生物学功能的分泌型重组hCREG/myc-His糖蛋白。

关键词：腺病毒E1A蛋白(E1A) 阻遏子真核表达载体糖蛋白