检索结果-南通市图书馆

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

阳离子脂质体诱导的细胞氧化应激损伤

中国细胞生物学学报 2020年第5期42卷 772-784页

作者：韩磊崔韶晖马启晨陈星妍王莹张树彪大连工业大学生物工程学院大连116034 大连民族大学生命科学学院生物技术与资源利用教育部重点实验室大连116601

人工合成制备的阳离子脂质体作为一种重要的基因和药物载体,具有很多优点,但其对细胞的毒性作用机制尚不明确,严重影响其临床应用。该文对阳离子脂质体是否通过诱导细胞产生氧化应激反应,进而导致细胞毒性的相关作用机制进行了研究。实... 详细信息

人工合成制备的阳离子脂质体作为一种重要的基因和药物载体,具有很多优点,但其对细胞的毒性作用机制尚不明确,严重影响其临床应用。该文对阳离子脂质体是否通过诱导细胞产生氧化应激反应,进而导致细胞毒性的相关作用机制进行了研究。实验使用人肺癌细胞(NCI-H460)和人胚肺正常细胞(MRC-5),采用CCK-8法、活性氧簇(ROS)荧光标记形态学观察、流式细胞术定量测定及活性氧簇自由基检测等方法,研究对比了三种头部结构不同,连接键和疏水尾部均相同的阳离子脂质体细胞毒性作用机制。这三种脂质体分别由三肽头部的N,N-双十四烷氧酰胺乙基三聚鸟氨酸酰胺(CDO14)、单季铵盐头部的N,N-双十四烷氧酰胺乙基-N,N-二甲基碘化铵(CDA14)和双季铵盐头部的1,2-双-[N-十四烷氧酰胺乙基-N,N-二甲基碘化铵]乙烷(CTA14)制备。研究结果表明,三种阳离子脂质体诱导的超氧化物、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(?OH)、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)等ROS均与作用剂量呈正相关,其中CDA14和CTA14高浓度处理组(0.10 μmol/L和0.20 μmol/L)与低浓度处理组(0.05 μmol/L常规转染浓度)及空白对照组相比差异极显著,而CDO14只在0.20 μmol/L处理组有显著差异,且三种脂质体对NCI-H460细胞的氧化应激损伤值均高于MRC-5细胞。因此,肽头部脂质体CDO14产生的氧化应激损伤远小于单季铵盐头部脂质体CDA14,而CDA14又小于双季铵盐头部脂质体CTA14。综上所述,阳离子脂质体诱导的细胞氧化应激损伤与其头部结构和剂量密切相关。该研究为阳离子脂质体的生物安全性及新型阳离子类脂结构设计提供科学参考。

关键词：阳离子脂质体载体细胞毒性 ROS 氧化应激

装载siRNA的纳米阳离子脂质体在小鼠体内的药代动力学研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

癌变．畸变．突变 2022年第6期34卷 445-448,462页

作者：问天娇陈欣然白靖郑颖王雅鹃于佩佩崔京霞河北医科大学第四医院药学部河北石家庄050011 石药集团中奇制药技术有限公司河北石家庄050035 河北医科大学药学院河北省创新药物研究与安全性评价重点实验室河北石家庄050017

目的:探讨siRNA药物的体内药代动力学评价方法,并分析脂质体作为药物载体的优势。方法:采用前期已构建的siRNA表达质粒及装载了该质粒的纳米隐形阳离子脂质体,将实验分为裸siRNA质粒组和siRNA质粒脂质体组,分别进行DNaseⅠ酶切和血清中... 详细信息

目的:探讨siRNA药物的体内药代动力学评价方法,并分析脂质体作为药物载体的优势。方法:采用前期已构建的siRNA表达质粒及装载了该质粒的纳米隐形阳离子脂质体,将实验分为裸siRNA质粒组和siRNA质粒脂质体组,分别进行DNaseⅠ酶切和血清中稳定性的检测。再将20μg siRNA裸质粒及siRNA质粒脂质体通过尾静脉注射进入小鼠体内,分别在注射后0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、12 h、24 h取血,采用实时荧光定量PCR方法(qPCR)对小鼠体内裸质粒及质粒脂质体进行定量检测,计算各时间点siRNA质粒的浓度。结果:裸质粒在DNaseⅠ中仅20 min就全部降解,质粒脂质体降解较缓慢,到24 h仍有(20.16±2.47)%的DNA残留;裸质粒在80%血清中20 min时仅残留(11.03±0.92)%,在1 h时基本全部降解,质粒脂质体在80%血清中24 h时仍残留(10.26±1.04)%,与裸质粒组相比,脂质体作为载体使siRNA表达质粒在DNaseⅠ及血清中的稳定性显著提高(P脂质体包裹的质粒半衰期约为2 h,而裸质粒仅为6 min,差异具有统计学意义(P脂质体的体内检测。阳离子脂质体能够保护核酸类药物进入体内,是一种高效的递送载体,同时脂质体能够提高药物的体内稳定性,延长药物的作用时间。

关键词：小干扰RNA 阳离子脂质体体内稳定性核酸定量检测药代动力学

阳离子脂质体介导血管内皮生长因子的基因表达

同方期刊数据库博看期刊评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

上海第二医科大学学报 1998年第2期18卷 93-96页

作者：何天源陈诗书钱虎声张柏根上海第二医科大学人类基因治疗中心 200025 上海第二医科大学附属仁济医院血管外科 200001

以 RT-PCR 自人胎肝中克隆和筛选血管内皮生长因子(VEGF)全长 cDNA,测序鉴定正确后,插入真核表达载体 pAdCMVlink1中的 EcoRI 和 KpnI 位点。用 lipofect AMINE 体外介导转染 CHO 细胞,收集转染后24h 至第5d 的培养上清,用 RT-PCR 检测... 详细信息

以 RT-PCR 自人胎肝中克隆和筛选血管内皮生长因子(VEGF)全长 cDNA,测序鉴定正确后,插入真核表达载体 pAdCMVlink1中的 EcoRI 和 KpnI 位点。用 lipofect AMINE 体外介导转染 CHO 细胞,收集转染后24h 至第5d 的培养上清,用 RT-PCR 检测转染细胞中外源 VEGF165基因的转录、Miles 试验检测细胞培养上清中 VEGF 的生物活性。结果表明,实验所克隆的 VEGF DNA 片段为含有信号肽结构的、长度为619bp 的全长 cDNA,与文献一致。外源基因在转染细胞中能有效转录,其分泌于培养上清中的表达产物具有强大的生物活性。

关键词： VEGF 阳离子脂质体基因治疗动脉疾病

阳离子脂质体化学发光催化性质的研究及其应用

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

阳离子脂质体化学发光催化性质的研究及其应用

作者：黄勇鑫天津大学

学位级别：硕士

化学发光(Chemiluminescence,CL)是指特定的化学反应产生光发射的一种发光现象,也就是至少两种物质发生化学反应时,产生激发态的高能中间体,此高能中间体从激发态回到基态的过程中以光子的形式释放能量的现象。化学发光产生的信号强度... 详细信息

化学发光(Chemiluminescence,CL)是指特定的化学反应产生光发射的一种发光现象,也就是至少两种物质发生化学反应时,产生激发态的高能中间体,此高能中间体从激发态回到基态的过程中以光子的形式释放能量的现象。化学发光产生的信号强度与参与反应的物质浓度相关。根据待测物质产生的发光强度来进行定量分析的方法称为化学发光分析法。随着新仪器的出现和科学技术的发展,化学发光法在二十世纪七十年代末期开始应用于分析化学领域。与其他分析方法相比,化学发光分析法具有灵敏度高、信噪比低、线性范围宽、仪器设备简单等优点。因此,化学发光分析法在临床诊断、食品安全、环境评估等领域的应用广泛。目前,常见的化学发光体系主要有过氧草酸酯化学发光体系,联吡啶钌化学发光体系,吖啶酯类化学发光体系和鲁米诺(luminol)化学发光体系。其中,鲁米诺化学发光体系的应用非常广泛。鲁米诺在碱性条件下可以被氧化剂氧化成激发态的3-氨基邻苯二甲酸(3-amino-1,2-benzenedicarboxylic acid*,3-APA*)。当激发态的3-APA*回到基态的时候,在425 nm处释放出光信号。鲁米诺-过氧化氢是一个常用的化学发光体系,当没有催化剂存在时,所产生的化学发光信号微弱。常见的催化剂有过氧化物酶如辣根过氧化物酶,金属离子和具有拟过氧化物酶活性的纳米材料等。近年来,多种纳米材料被报道具有拟过氧化物酶活性,可催化鲁米诺-过氧化氢化学发光反应,产生增强的化学发光信号。这些纳米材料包括贵金属纳米微粒如金纳米微粒、银纳米微粒、金纳米簇、铜纳米簇等,磁性纳米微粒,碳纳米材料如氧化石墨烯、碳纳米点等,金属有机骨架纳米材料,量子点等。脂质体(Liposome)是一种在水相中由磷脂双分子层定向排列而成的直径几十纳米至几微米的囊泡体。脂质体不仅比表面积大,而且具有大的亲水性内腔,可包入大量的信号响应分子。因此,脂质体在化学发光分析领域也有所应用。例如,各种酶(如辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶)和酶反应底物被包裹在脂质体的内水腔中,被用于化学发光生物传感和化学发光免疫分析等。在这些工作中,脂质体的主要作用是作为载体,被用于包载信号分子和偶联生物识别分子。虽然脂质体在化学发光分析领域已有所应用,但是脂质体作为催化剂,催化鲁米诺-过氧化氢体系发光的研究还未见报道。在实验中,我发现由带正电荷的磷脂1-(2,3-二油酰基)]-N,N,N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP)制备的阳离子脂质体能催化鲁米诺-过氧化氢反应产生增强的化学发光信号。因此,本论文以阳离子脂质体为研究对象,建立了阳离子脂质体催化的鲁米诺-过氧化氢化学发光反应,并将其应用于特定序列的DNA和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)的检测。研究内容详述如下。首先,采用薄膜分散法制备了DOTAP阳离子脂质体,所制备阳离子脂质体的粒径是105.5±1.2 nm,表面zeta电位是42.2 mV。35μg m L的DOTAP脂质体可将鲁米诺-过氧化氢化学发光反应信号增强8倍。为验证DOTAP脂质体在其中扮演的角色,我们设计了以下三个实验。第一,分别采用电中性磷脂1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(1,2-dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DSPC)和负电荷的磷脂二硬脂酰磷脂酰甘油(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1-rac-glycerol),DSPG)制备电中性脂质体和负电荷脂质体,并测定这两种脂质体对鲁米诺-过氧化氢化学反应的作用。结果显示,将这两种脂质体对鲁米诺-过氧化氢反应均无催化作用。第二,采用表面活性剂曲拉通(Tritox-100)破坏脂质体结构,测定阳离子脂质体破膜后对鲁米诺-过氧化氢化学反应的作用。结果显示,阳离子脂质体采用1%的Tritox-100破膜后,对鲁米诺-过氧化氢反应无催化作用。第三,采用负电荷的聚合物聚乙烯苯磺酸(Poly(sodium-p-styrene sulfonate),PSS)中和阳离子脂质体表面正电荷,测定阳离子脂质体被中和表面电荷后对鲁米诺-过氧化氢化学反应的作用。结果显示,阳离子脂质体表面zeta电位随着PSS浓度的增加而降低,其催化产生的化学发光信号也随PSS浓度的增加而降低。当体系中PSS浓度为8μM时,阳离子脂质体的表面zeta电位由42.2m V转变为-40.2 m V,此时90%的化学发光信号被抑制。以上结果表明,阳离子脂质体表面的正电荷对于其化学发光催化活性至关重要。鲁米诺在碱性条件下形成带负电荷的鲁米诺阴离子。因此,我们推测阳离子脂质体对鲁米诺阴离子

关键词：阳离子脂质体化学发光鲁米诺特定序列DNA 三磷酸腺苷

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

阳离子脂质体转染家蚕细胞技术体系的建立

阳离子脂质体转染家蚕细胞技术体系的建立

作者：刘敏西南大学

学位级别：硕士

利用阳离子脂质体Lipofectamine 2000与pBac[A3Neo+A3EGFP]表达载体，对BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四种细胞系进行了DNA量、脂质体量、血清含量和转染细胞的密度及转染细胞与转染液孵育时间等五个转染条件的优化实验，同时选择转染... 详细信息

利用阳离子脂质体Lipofectamine 2000与pBac[A3Neo+A3EGFP]表达载体，对BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四种细胞系进行了DNA量、脂质体量、血清含量和转染细胞的密度及转染细胞与转染液孵育时间等五个转染条件的优化实验，同时选择转染效率最高的BmN-SWU1细胞用G418进行筛选，完成了转基因细胞的建立。其主要研究结果如下： ***量的优化。优化时在五个培养孔中分别接种密度为2×10~5个／mL的细胞悬液0.5 mL，每孔加入2μl脂质体，DNA量设置了0.4μg、0.6μg、0.8μg、1.0μg和1.2μg五个质量梯度，无血清转染，转染24 h后移除转染液。优化后得到了BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四种细胞系的最优DNA量分别为0.6μg、0.4μg、1.0μg和0.6μg。 2．脂质体量的优化。优化时在细胞培养板的五个培养孔中分别接种密度为2×10~5个／mL的细胞悬液0.5 mL，每孔加入0.6μg质粒DNA，脂质体量设置了1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl和3.0μl五个体积梯度，无血清转染，转染24 h后移除转染液。优化后得到了BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四种细胞系的最优脂质体量分别为2.5μl、1.5μl、3.0μl和3μl。 3．被转染细胞密度的优化。在细胞培养板的培养孔中分别接种密度为0.5×10~5个／mL、1×10~5个／mL、2×10~5个／mL、3×10~5个／mL和4×10~5个／mL的BmN-SWU1、BmN和Sf21细胞0.5 mL，优化BmN-SWU2时，在培养孔中分别接种密度为1×10~5个／mL、2×10~5个／mL、3×10~5个／mL、4×10~5个／mL和5×10~5个／mL的细胞0.5 mL。每孔加入0.6μg质粒DNA，2μl脂质体，无血清转染，转染24 h后移除转染液。优化后得到了BmN-SWUⅠ、BmN-SWU2、BmN和Sf21等四种细胞系的最优被转染细胞密度分别为1×10~5个／mL、5×10~5个／mL、2×10~5个／mL和0.5×10~5个／mL。 4．共转染时间的优化。在培养孔中分别接种密度为2×10~5个／mL的BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21细胞悬液0.5 mL，每孔加入0.6μg质粒DNA，2μl脂质体，无血清转染，转染后于6 h、12 h、18 h、24 h和30 h时移除转染液。优化后得到了BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四种细胞系的最优共转染时间分别为24 h、6 h、24 h和12 h。 5．转染液中血清含量的优化。在培养孔中分别接种密度为2×10~5个／mL的BmN-SWU1、BmN和Sf21细胞悬液0.5 mL，分别加入无血清和有血清（5％）转染液;而优化BmN-SWU2时，在培养孔中分别接种密度为2×10~5个／mL的BmN-SWU2细胞悬液0.5 mL，分别加入含2.5％、5％、7.5％、10％和12.5％血清的转染液。每孔转染液中加入0.6μg质粒DNA，2μl脂质体，转染24h后移除转染液。优化后得到了BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四种细胞系的转染最优血清条件分别为无血清、5％血清、无血清和5％血清。 6．在BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf21四种细胞系各自最优条件下转染细胞，得到了四种细胞系的最高瞬时转染效率分别为55.08％、8.29％、2.0％和11.66％。 7．选用瞬时转染效率最高的BmN-SWU1细胞转染后用G418筛选，构建的BmN-SWU1的G418致死曲线表明，300μg／mL是BmN-SWU1细胞对G418的最小致死浓度。用400μg／mL的G418筛选转基因细胞14 d，得到了转基因细胞占60％以上的转基因细胞群体。挑取转基因细胞群体用200μg／mL的G418筛选五个月左右，得到转基因细胞占95％以上的转基因细胞群体。目前，转基因细胞群体已连续传至15代，且能在6-8 d传代一次，与未转染的BmN-SWU1细胞传代时间相当。本研究优化了阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和Sf2四个细胞系的转染条件，建立了阳离子脂质体转染家蚕细胞的技术体系，其中BmN-SWU1细胞系的最高转染效率达到55.08％，并且筛选出了转基因细胞占95％以上的BmN-SWU1细胞的转基因细胞系，为分析家蚕转基因载体的表达和家蚕工程细胞系的建立奠定了基础。

关键词：家蚕细胞转染阳离子脂质体转基因细胞系

阳离子脂质体导入单碱基编辑器治疗苯丙酮尿症的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

阳离子脂质体导入单碱基编辑器治疗苯丙酮尿症的研究

作者：秦凤铭四川大学

学位级别：硕士

目的:利用阳离子脂质体递送单碱基编辑器(Base editing)治疗苯丙酮尿症(PKU)。2016年David Liu开发的胞嘧啶碱基编辑工具cytosine base editors(CBE),使基因编辑工具进入到了“基因修正器”的时代。相比于传统的CRISPR/Cas9系统,单碱基... 详细信息

目的:利用阳离子脂质体递送单碱基编辑器(Base editing)治疗苯丙酮尿症(PKU)。2016年David Liu开发的胞嘧啶碱基编辑工具cytosine base editors(CBE),使基因编辑工具进入到了“基因修正器”的时代。相比于传统的CRISPR/Cas9系统,单碱基编辑工具将Cas9替换成无催化活性的Cas蛋白(d Cas)或单链DNA切割活性的Cas蛋白(n Cas)并与脱氨酶结合,在sg RNA的引导下实现基因位点的高效单点突变。与其他生物药物一样,基于CRISPR/Cas9的治疗药物通常需要一种运载工具将它们递送到靶器官、组织或者细胞。因此,高效、精准的递送载体就显得尤为重要,而目前大多数研究者所采用的递送工具为病毒载体。但由于病毒载体长期表达转基因的特性,使碱基编辑工具在体内长久持续的表达,引起非目标靶点编辑即脱靶效应、引起基因组大量插入或缺失突变从而破坏基因组的稳定性,甚者引起肿瘤;另外,病毒载体存在包载量有限、易引起免疫原性以及工业化生产困难等缺点,使其实现临床转化变得举步维艰。而非病毒载体则避免了上述不足,在本研究中,我们利用非病毒载体携带碱基编辑器,以苯丙酮尿症(PKU)为模型进行遗传病的体内治疗研究。PKU由苯丙氨酸羟化酶或辅酶四氢生物蝶呤缺乏引起的遗传性代谢疾病,而其中以苯丙氨酸羟化酶的基因发生突变造成的苯丙酮尿症占绝大部分(98%)。该疾病患者会出现发育迟缓、神经发育障碍头发、皮肤和眼睛色素沉着不足等症状。临床上针对患有此病的患者以低苯丙氨酸饮食和酶替代疗法为主,上述疗法存在花费巨大、用药时间长等特点易使患者依从性差,给患者的身心带来巨大的压力,患者更易抑郁而面临得精神疾病的风险增加。本研究利用阳离子脂质体将单碱基编辑系统递送到患苯丙酮尿症小鼠的肝脏细胞中,将突变的c.835C碱基纠正为正确的c.835T,从基因水平上纠正致病基因,为单碱基编辑在非病毒导入治疗单点突变所致遗传病提供参考。方法:针对苯丙酮尿症基因突变位点,利用来源于sp Cas9的3个碱基编辑工具和所对应的PKU sg RNA,将其转染PKU稳定株细胞,并从中筛选出编辑效率较高的碱基编辑器系统。接着,将筛选出的碱基编辑器系统通过体外转录成相应的RNA。与此同时,将制备的O-LLNs阳离子脂质体进行前期的表征、安全性考察后,我们将O-LLNs与Cre m RNA(1 mg/kg)共孵后通过尾静脉注射td Tomato成年小鼠,注射后3天安乐死小鼠,将脏器分离并在荧光体式镜下观察各脏器荧光表达情况,并进一步通过免疫组化、western blot分析td Tomato蛋白表达情况。随后,我们将上述复合物通过颊静脉注射出生2天的小鼠,待小鼠长到8周左右,安乐死小鼠,分离脏器并经荧光体式镜、免疫组化、western blot确定td Tomato蛋白在出生2天小鼠体内的表达情况。最后将转录得到的RNA与阳离子脂质体O-LLNs共孵形成脂质复合物。该复合物通过不同的给药方式注射PKU小鼠,并于注射后一周活检取肝脏,提取肝脏组织的DNA、RNA进行PCR扩增,经测序确认编辑效率。后于注射后3周,每周检测老鼠血苯丙氨酸含量、观察老鼠毛色改变以监测老鼠临床表型是否有所改善。后又将该复合物注射PKU出生2天的小鼠,并于注射后6周检测血苯丙氨酸含量、观察老鼠毛色改变以监测老鼠临床表型的改善情况。结果:单碱基编辑器系统:1)经细胞实验筛选出了编辑效率高的BE4-Cas9-NG-MAX/PKU sg RNA1-2单碱基编辑器系统;2)构建了质粒T7-BE4-Cas9-NG-MAX,并成功转录出BE4-Cas9-NG-MAX/PKU sg RNA1-2所对应的RNA(CBE m RNA)。阳离子脂质体O-LLNs:1)制剂表征得出该制剂的粒径大小约120nm,粒径分布约0.35,Zeta电位为35 m W;2)透射电镜得出该阳离子脂质体外形呈类球形,形态大小分布均匀,无粘连;3)苏木素-伊红染色和血生化分析确认制剂安全性高,对小鼠不会造成安全性危害;4)O-LLNs/Cre复合物在td Tomato成年小鼠,荧光体式镜可见肝脏、脾脏和肺具有明显荧光,其他脏器未见荧光;免疫组化确认O-LLNs主要靶向肝实质细胞;western blot分析得出O-LLNs主要靶向肝脏,脾脏和肺相对较低;5)O-LLNs/Cre复合物在出生两天的td Tomato小鼠,荧光体视镜可见肝脏具有强荧光,脾脏和肺的荧光明显降低;6)在O-LLNs/Cre复合物注射td Tomato小鼠实验中,通过荧光体式镜、免疫组化、western blot实验对成年鼠和新生鼠的制剂的肝脏靶向性进行比较,发现该复合物在新生鼠的肝脏靶向性稍高于成年鼠。PKU治疗实验:1)经深度测序确认PK

关键词：阳离子脂质体 CRISPR/Cas9 mRNA 单碱基编辑 PKU

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

阳离子脂质体的细胞毒性作用研究

阳离子脂质体的细胞毒性作用研究

作者：关迪大连工业大学

学位级别：硕士

近年来，阳离子脂质体运送核酸（药物）的相关研究发展迅速，然而，阳离子脂质体载体还存在着细胞转染效率不高和有一定细胞毒性等问题。尤其是对于其毒性产生的原因以及毒性作用的机制尚不十分明确，从而在一定程度上影响了其在治疗上... 详细信息

近年来，阳离子脂质体运送核酸（药物）的相关研究发展迅速，然而，阳离子脂质体载体还存在着细胞转染效率不高和有一定细胞毒性等问题。尤其是对于其毒性产生的原因以及毒性作用的机制尚不十分明确，从而在一定程度上影响了其在治疗上的使用。因此，深入探讨阳离子脂质体基因载体对于细胞的毒性作用机制对其应用具有重要的意义。本文对DDCTMA阳离子脂质体作用于体外培养的人喉癌细胞系(Hep-2)细胞产生的细胞毒性机制进行了研究。首先使用MTT法检测了不同浓度的DDCTMA作用下细胞的存活率，并使用商品脂质体进行对比。检测结果表明，随着脂质体浓度的升高，细胞的存活率呈明显下降趋势，当其浓度过大时，细胞大量死亡。据此选择适当浓度的DDCTMA脂质体分别处理Hep-2细胞，对处于不同状态的细胞分别进行染色处理，利用倒置荧光显微镜进行观测，结果表明，DDCTMA能引起细胞凋亡。进而使用细胞凋亡荧光Hoechst33258检测法对凋亡细胞进行了形态学鉴定，能够清楚地观察到细胞凋亡现象。DDCTMA脂质体的浓度越大，凋亡细胞的数量也越多，浓度过大时，可以使细胞直接破碎死亡。通过对Caspase-3和Caspase-9的酶活力变化定量检测证明了随着脂质体浓度的升高，其酶活力都相应的增高，从而引起凋亡反应。研究结果表明，DDCTMA脂质体对Hep-2细胞的毒性作用为既能引起细胞坏死，也能诱导细胞凋亡。

关键词：阳离子脂质体基因转运 DDCTMA 细胞毒性细胞凋亡

阳离子脂质体—重组人内皮抑素腺病毒复合物靶向抗肿瘤治疗研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

阳离子脂质体—重组人内皮抑素腺病毒复合物靶向抗肿瘤治疗研究

作者：王莉四川大学

学位级别：硕士

目的：大多数恶性实体肿瘤包括卵巢癌的生长及转移依赖于新生血管的形成，肿瘤微血管密度与其恶性程度和生物学特性密切相关。大部分的卵巢癌患者发现时已属晚期，由于卵巢癌组织学的复杂性和诊疗的困难，使其成为妇科领域的主要研究课... 详细信息

目的：大多数恶性实体肿瘤包括卵巢癌的生长及转移依赖于新生血管的形成，肿瘤微血管密度与其恶性程度和生物学特性密切相关。大部分的卵巢癌患者发现时已属晚期，由于卵巢癌组织学的复杂性和诊疗的困难，使其成为妇科领域的主要研究课题。尽管肿瘤手术治疗与化疗联合治疗有一定疗效，但广泛的盆腹腔肿瘤转移使手术难以将肿块切除干净，其复发率和死亡率仍较高。目前其治疗方法虽多，但5年生存率尚无明显改善。因此需探讨一种新的治疗理念和方法，以期改善卵巢癌的预后。以肿瘤的新生血管为靶向的抗血管生成治疗，已成为治疗肿瘤的一种新途径，内皮抑素(Endostatin)是ⅩⅧ型胶原C-末端分子量约20KD的片段，由184个氨基酸组成，是内源性血管抑制因子，能特异地抑制血管内皮细胞的生长，从而有效地抑制肿瘤新生血管的形成，它被公认为是目前最有效的血管生成抑制剂。而阳离子脂质体(Cationic liposome，lipo)具有高度的生物靶向性，长效缓释性，能够降低被包裹抗原的毒性，增强动物耐受高剂量病原微生物或其毒素攻击的能力，其在血液中驻留时间延长、作用持久，可有效到达病变部位，提高靶向组织的选择性。阳离子脂质体与腺病毒形成复合物后，可有效地提高腺病毒在柯萨奇-腺病毒受体(coxsackie-adenovirus receptor，CAR)低表达的肿瘤细胞株的转染效率，保护腺病毒不被中和抗体作用，提高其作用效果。在本研究中，我们采用复制缺陷型腺病毒作为载体，构建了表达入内皮抑素的重组腺病毒(Ad-hEndo)并用阳离子脂质体包裹形成复合物，将复合物通过静脉注射入荷卵巢癌裸鼠体内，观察其靶向抗卵巢癌作用，并对其作用机制进行初步探讨。方法： (1)阳离子脂质体的制备二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、胆固醇(CHOL)比例为1：1：0．1。用三氯甲烷和甲醇的有机溶液溶解，旋转蒸发后，不超过40℃温度下，真空干燥2小时，加入灭菌水，在氮气保护下，超声破碎即得阳离子脂质体。 (2)阳离子脂质体-腺病毒复合物的制备将重组绿色荧光蛋白腺病毒(Ad-GFP)与不同浓度的阳离子脂质体混匀后制备成复合物在室温下放置20分钟后待用。 (3)在透射电镜下观察阳离子脂质体-腺病毒复合物形态。 (4)优化实验：不同浓度阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒(lipo+Ad-GFP)复合物转染人卵巢浆液性囊腺癌(SKOV)细胞株，流式细胞术(FACS)测定其转染效率，确定优化比例。 (5)用阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒(Ad-hEndo)复合物转染SKOV细胞株，Western blot鉴定。 (6)检测尾静脉注射阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物在裸鼠肿瘤组织内不同时段的表达。 (7)尾静脉注射阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物抗肿瘤效果实验观察建立BALB／c裸鼠卵巢癌(SKOV)动物肿瘤模型，将荷瘤裸鼠随机分为6组，即生理盐水组、单脂质体组、阳离子脂质体-未重组的腺病毒空载体组、重组人内皮抑素腺病毒组、阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物高剂量治疗组(200μg脂质体+1×10pfu重组人内皮抑素腺病毒)、阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物低剂量治疗组(20μg脂质体+1×10pfu重组人内皮抑素腺病毒)。观察阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物对肿瘤生长的影响，通过测量肿瘤体积、肿瘤重量、免疫组化检测微血管密度、原位缺如末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡探讨抗肿瘤作用。 (8)体外实验：阳离子脂质体-腺病毒复合物对中和抗体作用的观察。重组绿色荧光蛋白腺病毒和阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物分别与倍比稀释的抗腺病毒抗体血清37℃孵育90分钟，之后再分别转染SKOV细胞，24小时后荧光显微镜下评价抗体中和活性。结果： (1)透射电镜下显示，经处理的阳离子脂质体多为圆形或椭圆形多层小囊泡形态，大小在80～100nm之间，分布均匀，没有跨距;腺病毒颗粒散在或聚集成堆，呈球状;腺病毒颗粒被阳离子脂质体均匀包裹，包被在腺病毒颗粒外的阳离子脂质体呈多层洋葱片样结构。 (2)阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物的优化实验结果得出，阳离子脂质体：重组绿色荧光蛋白腺病毒的最佳比例为10μg：5×10pfu，此研究结果用于进行下一步实验。 (3)Western blot分析显示重组人内皮抑素腺病毒转染的SKOV细胞裂解液可与抗内皮抑素的标准抗体发生反应，在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上形成一条与预期蛋白分子量一致的条带，表明重组腺病毒在体外转染细胞能够正确表达所需目的蛋白。 (4)阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物在裸鼠肿瘤内的表达实验表明：实验组(Lipo+Ad-G

关键词：重组腺病毒阳离子脂质体内皮抑素抗血管生成基因治疗卵巢肿瘤

万古霉素阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡甘聚糖治疗兔慢性感染性骨缺损

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

中国修复重建外科杂志 2012年第2期26卷 190-195页

作者：黄金亮马涛唐辉范新宇徐永清成都军区昆明总医院全军骨科中心昆明650032

目的检验阳离子脂质体包封万古霉素复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡甘聚糖(nanohydroxyapatite/chitosan/koniac glucomannan,n-HA/CS/KGM)支架体内抗感染及骨修复活性。方法取6月龄健康新西兰大白兔51只,体重1.5～3.0kg,用金黄色葡... 详细信息

目的检验阳离子脂质体包封万古霉素复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡甘聚糖(nanohydroxyapatite/chitosan/koniac glucomannan,n-HA/CS/KGM)支架体内抗感染及骨修复活性。方法取6月龄健康新西兰大白兔51只,体重1.5～3.0kg,用金黄色葡萄球菌制备慢性感染性双侧胫骨骨缺损模型。将造模后4周存活的48只兔随机分为4组,每组12只。根据以下分组方法,分别于双侧骨缺损处植入相应支架。A组;清创后不作任何处理;B组:n-HA/CS/KGM空白支架组;C组:万古霉素复合n-HA/CS/KGM支架组;D组:万古霉素阳离子脂质体复合n-HA/CS/KGM支架组。治疗后8周行大体、骨缺损修复、组织学观察以及X线片、细菌学检查。结果实验动物造模后4周X线片显示明显骨质缺损、低密度影及软组织肿胀影,Norden评分均>3分,为(3.83±0.52)分。治疗后8周大体观察:C、D组窦道已愈合,A、B组仍有窦道;大体观察病理评分C、D组明显优于A、B组(P阳离子脂质体复合n-HA/CS/KGM支架可很好治疗兔慢性感染性胫骨骨缺损,为临床上治疗慢性感染性骨缺损提供了新思路。

关键词：纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡甘聚糖支架阳离子脂质体万古霉素感染性骨缺损兔