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植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建

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作物学报 2012年第4期38卷 639-647页

作者：李俊刘信曹应龙武玉花厉建萌吴刚张丽卢长明中南民族大学生命科学学院湖北武汉430074 中国农业科学院油料作物研究所湖北武汉430062 农业部科技发展中心北京100026

植酸酶基因在农业生产中具有很高的应用价值,正被广泛用于农作物的基因工程研究。为了满足转植酸酶基因作物安全监管的需要,通过优化PCR检测条件,建立了植酸酶基因特异性定性PCR检测方法。该方法具有良好的扩增特异性和检测灵敏度,可以... 详细信息

植酸酶基因在农业生产中具有很高的应用价值,正被广泛用于农作物的基因工程研究。为了满足转植酸酶基因作物安全监管的需要,通过优化PCR检测条件,建立了植酸酶基因特异性定性PCR检测方法。该方法具有良好的扩增特异性和检测灵敏度,可以满足我国植酸酶转基因作物监管需要。此外,我们将6种主要农作物(小麦、水稻、棉花、大豆、玉米和油菜)的内标准基因和植酸酶基因克隆到同一载体上,构建成了阳性质粒分子pBS Endogenous-phytase。该质粒分子适用于这6种作物中植酸酶基因的筛查检测。本研究为转植酸酶基因作物的安全监管提供了阳性材料和检测方法。

关键词：转基因检测植酸酶基因定性PCR 阳性质粒分子

肉制品中毛皮动物源性成分掺假检测阳性质粒分子的构建与评价

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中国食品卫生杂志 2023年第3期35卷 360-366页

作者：翟清燕霍胜楠姚现琦郑世超王骏任易婕孙潇慧杜东旭山东省食品药品检验研究院山东济南250000 国家市场监管重点实验室肉及肉制品监管技术山东济南250000 临沂金锣文瑞食品有限公司山东临沂276000

目的建立一种肉制品中毛皮动物源性成分掺假快速检测技术。方法构建狐狸、貉、水貂三种检测用阳性质粒分子,利用实时荧光定量PCR方法对其特异性、灵敏度和方法适用性等关键指标进行分析。结果构建好的狐狸、貉、水貂阳性质粒分子特异性... 详细信息

目的建立一种肉制品中毛皮动物源性成分掺假快速检测技术。方法构建狐狸、貉、水貂三种检测用阳性质粒分子,利用实时荧光定量PCR方法对其特异性、灵敏度和方法适用性等关键指标进行分析。结果构建好的狐狸、貉、水貂阳性质粒分子特异性强、灵敏度高,检验灵敏度均可达到10^(-4)ng/μL,标准曲线扩增效率分别为94.451%、117.461%、114.709%,且相关系数(R^(2))均在0.995以上。在混合肉样品和市售肉制品中均可检测,三种成分的检测限均低至1%,具有较好的可行性及适用性。结论本方法构建的三种阳性质粒分子可以满足实际工作中肉类掺假检测的需求。

关键词：毛皮动物阳性质粒分子特异性灵敏度

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转基因番木瓜阳性质粒分子的构建和应用

分子植物育种 2022年第18期20卷 6041-6048页

作者：陈伟庭高洁儿潘志文周峰王声斌姜大刚姚涓华南农业大学生命科学学院农业农村部植物及植物用微生物生态环境安全监督检验测试中心(广州)广州510642

转基因抗病番木瓜已经获得了全球多个国家的商业化应用和进口批准。为了解决转基因番木瓜检测工作中存在阳性对照不易获取的问题,本研究通过基因数据库(美国国家生物信息中心,NCBI),筛选番木瓜内标准基因Papain和Chymopapain基因以及已... 详细信息

转基因抗病番木瓜已经获得了全球多个国家的商业化应用和进口批准。为了解决转基因番木瓜检测工作中存在阳性对照不易获取的问题,本研究通过基因数据库(美国国家生物信息中心,NCBI),筛选番木瓜内标准基因Papain和Chymopapain基因以及已经报道的番木瓜转化体‘华农1号’、‘55-1’和‘GM YK’的特异性序列,构建了转基因番木瓜阳性质粒分子,并对其特异性、灵敏度以及适用性进行了验证分析,结果表明:该阳性质粒分子包含的5个外源片段的扩增产物条带清晰、特异性好,检测灵敏度高,可以稳定地检测出100个拷贝的质粒分子;同时对质粒分子的适用性进行了测试,结果显示,构建的质粒分子可以应用于番木瓜组织和加工品的转基因检测中。由此表明本研究构建的转基因番木瓜阳性质粒分子可以作为阳性对照应用于转基因番木瓜的特异性检测。

关键词：转基因番木瓜阳性质粒分子检测事件特异性

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转基因水稻检测用阳性质粒分子的构建及应用

生物技术通报 2013年第7期29卷 71-77页

作者：李晓飞谭小力李俊武玉花曹应龙江苏大学生命科学研究院镇江212013 中国农业科学研究院油料作物研究所武汉430062

通过分析转基因水稻(Oryza sativa)中调控元件和功能基因的种类及应用频率,结合水稻基因工程研究中标记基因的使用情况,确定将CaMV35S启动子、NOS终止子,标记基因Bar、HPT和NPTⅡ基因作为转基因水稻的筛查检测靶标。通过重叠延伸PCR技术... 详细信息

通过分析转基因水稻(Oryza sativa)中调控元件和功能基因的种类及应用频率,结合水稻基因工程研究中标记基因的使用情况,确定将CaMV35S启动子、NOS终止子,标记基因Bar、HPT和NPTⅡ基因作为转基因水稻的筛查检测靶标。通过重叠延伸PCR技术,将水稻内标基因SPS、筛选靶标(CaMV35S启动子、NOS终止子、Bar基因、HPT基因和NPTⅡ基因)、事件特异性检测靶标(TT51-1、KF-6和KMD1)聚合克隆到质粒载体上,构建质粒分子pBS Rice。应用结果表明,阳性质粒分子pBS Rice既适用于转基因水稻的筛查检测,也适用于抗虫水稻TT51-1、KF-6和KMD1的事件特异性检测。研究结果为转基因水稻安全监管提供了一种不依赖于转基因水稻原材料供应的阳性对照,其对目前国内外批准的转基因水稻检出率达100%,满足了监管过程中转基因水稻的检测需要。

关键词：转基因水稻阳性质粒分子定性PCR 筛查检测事件特异性检测

两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立

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食品研究与开发 2018年第10期39卷 110-115页

作者：翟清燕郑世超霍胜楠山东省食品药品检验研究院山东济南250101

旨在构建水貂、紫貂两种成分的阳性质粒分子,对该方法的特异性和灵敏度进行验证,同时对3家公司合成的引物、探针进行比较,对实时荧光PCR反应体系进行优化。结果表明,该检测方法具有较好的特异性和较高的灵敏度,所选择的3家公司的引物、... 详细信息

旨在构建水貂、紫貂两种成分的阳性质粒分子,对该方法的特异性和灵敏度进行验证,同时对3家公司合成的引物、探针进行比较,对实时荧光PCR反应体系进行优化。结果表明,该检测方法具有较好的特异性和较高的灵敏度,所选择的3家公司的引物、探针均具有较高的检出限,为貂成分检测提供一个新型阳性对照,解决了阳性物质难获取的问题。

关键词：阳性质粒分子特异性灵敏度引物探针

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转基因作物检测阳性质粒分子的研制及应用

转基因作物检测阳性质粒分子的研制及应用

作者：李俊中南民族大学

学位级别：硕士

随着我国转基因技术的不断发展，转基因作物产业化规模的不断扩大，转基因作物的种类和数量不断增加，转基因作物安全管理的任务将越来越繁重，尤其是非法释放到环境中的转基因产品时有发生，试验阶段转基因生物的安全监管工作将是我国... 详细信息

随着我国转基因技术的不断发展，转基因作物产业化规模的不断扩大，转基因作物的种类和数量不断增加，转基因作物安全管理的任务将越来越繁重，尤其是非法释放到环境中的转基因产品时有发生，试验阶段转基因生物的安全监管工作将是我国转基因生物安全管理的重点和难点。在试验阶段转基因作物阳性样品非常有限的情况下，如何根据转基因作物本身的遗传信息研发出容易获取的、可大量生产的标准物质，以满足转基因作物安全监管工作的需求至关重要，转基因作物检测阳性质粒分子是满足我国当前需要的最优选择。本研究以处于试验阶段、尚未进入商业化应用、亟需研制标准物质的转基因作物为研究对象，建立相应的检测方法并制备适合这类作物的阳性质粒分子，来解决因无法大量获得这些转基因品种的基体阳性物质而难以进行转基因检测、监测的难题。本研究取得的创新结果有以下几个方面： 1、建立4个检测方法。根据耐除草剂G2-aroA基因、真菌来源的植酸酶基因序列、转基因水稻T1c-19和T2A5’端的转化体序列信息，通过引物设计与优化，Mg浓度、引物浓度、退火温度梯度优化，建立了G2-aroA基因和植酸酶基因，T1c-19和T2A事件特异性检测方法。结果表明检测方法均具有良好的特异性和灵敏度，灵敏度均能够达到0.1%，可以满足我国转基因成分定性检测对灵敏度的要求。 2、构建了适用于6大作物(水稻、玉米、大豆、棉花、小麦和油菜)筛查用的内标准基因阳性质粒分子pBSEndogenous。根据国家标准中玉米内标基因zSSIIb、油菜内标基因HMGI/Y、小麦内标基因waxy-D1、水稻内标基因SPS、棉花内标基因Sad1和大豆内标准基因Lectin序列信息，构建了内标准基因特异性检测阳性质粒分子pBSEndogenous，实验结果表明，该质粒具有较好的特异性和检测灵敏度，能够用于内标准基因扩增的阳性对照。 3、构建了7种基因特异性筛查检测的阳性质粒分子pBar、pPAT、pEPSPS(Mo)、pEPSPS(Na)、pG2-aroA、pCry1Ab/1Ac、pPhytase。将转基因检测中常用的筛查基因Bar、PAT、CP4-EPSPS(天然的)、CP4-EPSPS(修饰的)、G2-aroA、Cry1Ab/1Ac、Phytase克隆至质粒载体中，研制了7种基因特异性阳性质粒分子，实验结果表明这些质粒分子均具有很强的基因特异性，适合用于转基因作物中的基因鉴别。定性PCR检测灵敏度均能达到50拷贝μL，其中pG2-aroA检测极限能够达到10拷贝μL。 4、研制了四种转基因作物(水稻、棉花、玉米、大豆)的12种转化事件特异性阳性质粒分子和2种构建特异性阳性质粒分子(pCV127-G和pBVLA430101-G)。其中pKF6、pM12、pT1c-19、pT2A、pKMD分别用于转基因水稻科丰6号、M12、T1c-19、T2A和克螟稻1号的检测;pEZM1、pNN98-7分别用于鄂杂棉1号、南农98-7的检测;pA27042、pA554727、pCV127-Z分别用于转基因大豆A27042、A554727、CV127的检测;pBVLA430101-Z、pMIR162分别用于转植酸酶玉米BVLA43010和MIR162的检测。实验表明这些质粒分子在定性PCR检测过程中，检测极限均能达到50拷贝μL，其中pM12、pEZM1、pMIR162、pCV127-G检测极限能够达到10拷贝μL。 5、组织10家国内具有资质的检测机构对所构建的4个检测方法和研制的22种阳性质粒分子的适用性进行了验证，分别确定了21种阳性质粒分子应用的适用浓度。检测方法验证结果表明：所有检测方法特异性强，灵敏度高，能达到0.1%，并且检测结果均具有很好的可重复性和重现性。本论文研制的阳性质粒分子能够替代相应基体阳性材料，作为转基因检测中的阳性质控对照。 6、运用本文的研究成果，对我国研发的三种转基因水稻科丰6号、克螟稻1号、TT51进行了筛查检测。结果表明本论文建立的阳性质粒分子适用于实际转基因检测。

关键词：阳性质粒分子转基因检测定性PCR 转基因水稻转基因棉花转基因大豆转基因玉米

转基因水稻筛查检测阳性质粒pUC18-RICE-screen的构建及分子评价

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农业生物技术学报 2020年第7期28卷 1177-1192页

作者：马卉焦小雨许学李夏莹陈子言吴爽潘伟芹张秀杰汪秀峰安徽省农业科学院水稻研究所农业农村部科技发展中心

标准物质是转基因生物安全监管和检验检测工作中进行质量控制的关键。目前,国内用于转基因检测的阳性对照资源匮乏,主要为基体标准物质,难以满足转基因生物安全监管和检测工作的需要。质粒标准物质作为转基因检测标准物质新的发展方向,... 详细信息

标准物质是转基因生物安全监管和检验检测工作中进行质量控制的关键。目前,国内用于转基因检测的阳性对照资源匮乏,主要为基体标准物质,难以满足转基因生物安全监管和检测工作的需要。质粒标准物质作为转基因检测标准物质新的发展方向,具有广泛的应用价值。本研究通过收集整理相关数据库信息,获得了国内外19种主要转基因水稻（Oryza sativa）品系的遗传信息,全面分析其外源基因表达框中调控元件/基因的组成情况及使用频率,并结合目前现有转基因检测技术标准,确定了以水稻内标基因磷脂酶D基因（phospholipase D gene, PLD）、蔗糖磷酸合酶基因（sucrose phosphate synthase gene, SPS）和靶标基因CaMV35S启动子(35S promoter from Cauliflower mosaicvirus, P;)、Ubiquitin启动子(ubiquitin promoter from maize, P;)、CaMV35S终止子、NOS终止子(terminator of nopaline synthase gene, T;)、抗草丁膦除草剂基因（bialaphos resistance gene, Bar）、潮霉素磷酸转移酶基因（hygromycin phosphotransferase gene, HPT）、苏云金芽胞杆菌基因（Bacillus thuringiensis gene, Bt）等9个调控元件/基因用于构建阳性质粒pUC18-RICE-screen。该质粒通过人工合成技术获得,经酶切、测序、PCR验证,以及对检测不同筛查元件/基因的适宜质粒浓度进行综合评价,结果表明,该质粒可用于本研究所涉19个转基因水稻的筛查检测,且其作为阳性对照用于各筛查元件/基因PCR和qRT-PCR筛查检测的适宜浓度范围为1×10;～1×10;copies/μL。本研究为转基因水稻安全监管提供了一种不依赖于转基因水稻原材料的阳性对照,也为解决转基因水稻阳性标准品匮乏问题供了技术支持。

关键词：转基因水稻阳性质粒分子调控元件筛查检测

三种植物源性成分阳性质粒的构建及检测方法的验证

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食品与发酵工业 2020年第17期46卷 237-241页

作者：翟清燕任易婕郑世超霍胜楠山东省食品药品检验研究院山东济南250101 山东省食品药品安全检测工程技术研究中心山东济南250101

植物蛋白饮料含有丰富的营养成分,深受广大消费者的喜爱。但由于利益驱使,掺假现象也逐年增加。针对此现象构建了核桃、花生、大豆3种植物成分的阳性质粒分子,对3种阳性质粒分子的特异性和灵敏度进行了验证,并对实时荧光PCR反应体系中... 详细信息

植物蛋白饮料含有丰富的营养成分,深受广大消费者的喜爱。但由于利益驱使,掺假现象也逐年增加。针对此现象构建了核桃、花生、大豆3种植物成分的阳性质粒分子,对3种阳性质粒分子的特异性和灵敏度进行了验证,并对实时荧光PCR反应体系中不同品牌PCR预混液效果进行了对比分析。结果表明,构建的核桃、花生、大豆阳性质粒分子均具有特异性强、灵敏度高等特点,检验灵敏度均可达到10-5 ng/μL;标准曲线扩增效率分别为93.299%、123.623%和132.975%,且相关线性系数R 2均在0.99以上。综上所述,3种品牌的PCR预混液均具有很高的灵敏度,均可以满足核桃、花生和大豆日常检验工作的要求,对于植物源性成分的鉴定具有重要意义。

关键词：阳性质粒分子特异性灵敏度 PCR预混液

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3种动物源性成分阳性质粒构建及检测研究

食品研究与开发 2018年第6期39卷 135-142页

作者：郭颖慧郑世超霍胜楠山东省食品药品检验研究院山东济南250101

为准确、快速地进行食品中狐狸、驴、马成分的定量检测,选择适宜高效的聚合酶,本研究利用荧光定量聚合酶链式反应(real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)的方法构建狐狸、驴、马源性成分检测的3种阳性... 详细信息

为准确、快速地进行食品中狐狸、驴、马成分的定量检测,选择适宜高效的聚合酶,本研究利用荧光定量聚合酶链式反应(real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)的方法构建狐狸、驴、马源性成分检测的3种阳性质粒分子,对3种质粒分子的方法特异性、灵敏度进行验证,并对实时荧光PCR反应体系中脱氧核糖核酸(Deoxyribose Nucleic Acid,DNA)聚合酶效果进行对比分析。研究结果发现,所选择的3种品牌的反应液和脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside Triphosphate,d NTP)均具有很高的灵敏度,检出限略微有差异,均可满足日常检验工作的需要。

关键词：阳性质粒分子实时荧光PCR 特异性灵敏度 DNA聚合酶