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间斑寇蛛毒素的蛋白质化学与蛋白质组学研究新进展

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生物工程学报 2014年第7期30卷 1036-1043页

作者：王贤纯梁宋平湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室湖南长沙410081

间斑寇蛛Latrodectus tredecimguttatus俗称"黑寡妇"蜘蛛。其毒素不仅存在于毒腺中,而且存在于其身体的其他部分、卵粒甚至新生幼蛛体内。研究间斑寇蛛毒腺和毒腺外材料中的毒素成分,探明它们之间的异同、进化关系和生物学作用,具有重... 详细信息

间斑寇蛛Latrodectus tredecimguttatus俗称"黑寡妇"蜘蛛。其毒素不仅存在于毒腺中,而且存在于其身体的其他部分、卵粒甚至新生幼蛛体内。研究间斑寇蛛毒腺和毒腺外材料中的毒素成分,探明它们之间的异同、进化关系和生物学作用,具有重要的理论和实际意义。现代蛋白质化学和蛋白质组学技术的发展为间斑寇蛛蛋白质和多肽毒素的研究提供了有效手段,从而可以同时从单一纯化蛋白质和组学的层面探究毒素作用的分子基础和作用机制。到目前为止,间斑寇蛛毒素的蛋白质化学与蛋白质组学研究已取得一定的进展,但相关研究尤其是毒腺外材料来源的毒素研究还有待进一步深入。

关键词：毒素蛋白质多肽间斑寇蛛进展

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间斑寇蛛幼蛛过冬及其早期饲养管理

生态学杂志 2007年第3期26卷 363-367页

作者：段志贵晏晓军邓星灿王贤纯湖南师范大学生命科学学院长沙410081

间斑寇蛛幼蛛过冬和早期饲养管理是人工饲养的关键。通过比较不同保存温度和不同保存时间下过冬幼蛛的孵化率、存活率和平均体质量，研究了间斑寇蛛幼蛛过冬的规律，并探讨了相对湿度、环境温度和食物种类对幼蛛离开卵囊后的早期生长发... 详细信息

间斑寇蛛幼蛛过冬和早期饲养管理是人工饲养的关键。通过比较不同保存温度和不同保存时间下过冬幼蛛的孵化率、存活率和平均体质量，研究了间斑寇蛛幼蛛过冬的规律，并探讨了相对湿度、环境温度和食物种类对幼蛛离开卵囊后的早期生长发育的影响。结果表明：4℃左右是比较理想的卵囊保存过冬温度，但在此温度下保存7个月后存活率开始下降，到13个月幼蛛存活率降为零；卵囊放入低温保存前需在室内放置一段时间（约2个月）以使卵粒孵化成幼蛛；4℃左右下过冬的幼蛛离开卵囊后，在相对湿度55％～60％、环境温度25℃～30℃的条件下，用黄粉虫喂养4周后体质量增长40余倍，成活率达80％以上。

关键词：间斑寇蛛幼蛛过冬早期饲养

间斑寇蛛粗毒液的生理生化分析及两种采毒方法的比较

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Zoological Research 2009年第4期30卷 381-388页

作者：段志贵杨静晏晓军曾雄智王贤纯梁宋平湖南师范大学蛋白质化学及发育生物学教育部重点实验室湖南长沙410081 湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室湖南长沙410081

利用两种不同方法采集间斑寇蛛(Latrodectus tredecimguttatus)毒液并对其进行理化和生物学性质的比较分析。结果显示,粗毒液中的蛋白质成分主要是相对分子质量较大(>104)的酸性蛋白质。与毒囊粗毒液相比,电刺激粗毒液中相对分子质量在... 详细信息

利用两种不同方法采集间斑寇蛛(Latrodectus tredecimguttatus)毒液并对其进行理化和生物学性质的比较分析。结果显示,粗毒液中的蛋白质成分主要是相对分子质量较大(>104)的酸性蛋白质。与毒囊粗毒液相比,电刺激粗毒液中相对分子质量在105左右的蛋白质含量明显高于毒囊粗毒液中的含量,而两者中相对分子质量较小(间为(23.3±2.2)min;粗毒液中的低相对分子质量(间斑寇蛛毒液是一种富含大分子量蛋白质的混合物;哺乳动物神经毒性主要基于其中的大的相对分子质量酸性蛋白质成分,而不是低的相对分子质量的多肽;电刺激粗毒液中的活性成分与毒囊粗毒液中的相似,但含量高于毒囊粗毒液。

关键词：间斑寇蛛粗毒液粗毒液采集性质比较分析

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间斑寇蛛粗毒的生物学特性

动物学报 2007年第4期53卷 682-688页

作者：杨静段志贵周红晏晓军何小珍王贤纯梁宋平湖南师范大学生命科学学院长沙410081

近几十年来,间斑寇蛛(Latrodectus tredecimguttatus)已引起相关研究工作者的广泛关注,因为阐明其毒液中的特异性蛋白质和多肽活性成分对蜘蛛咬伤治疗具有重要的意义,且其粗毒液中的生物学活性成分在神经生物学和药物研究方面也有着潜... 详细信息

近几十年来,间斑寇蛛(Latrodectus tredecimguttatus)已引起相关研究工作者的广泛关注,因为阐明其毒液中的特异性蛋白质和多肽活性成分对蜘蛛咬伤治疗具有重要的意义,且其粗毒液中的生物学活性成分在神经生物学和药物研究方面也有着潜在的应用前景。但直到现在,尽管已有不少研究报道了包括α-latrotoxin在内的几种间斑寇蛛毒性蛋白质的生物学性质和结构,但有关毒液生物学特性的系统研究的报道还很少。本研究采用解剖分离毒囊的方法从产于我国新疆的间斑寇蛛提取粗毒,并对其理化和生物学性质进行了系统的分析。定量测定结果表明,粗毒的蛋白质含量为36.99%,对小鼠和蜚蠊的LD50分别为0.39mg/kg和2.32μg/g体重。小鼠经腹腔注射粗毒后,出现呆滞、共济失调、排汗、痉挛、食欲减退、呼吸短促、睁眼困难等中毒症状,而注射生理盐水的对照小鼠活动正常。粗毒具有透明质酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、脱氧核糖核酸酶、乙酰胆碱酯酶、蛋白水解酶等多种水解酶的活性。10μg/ml该粗毒可以在31min±3.05min内完全抑制电刺激引起的大鼠输精管的收缩反应。6μg/ml粗毒可在25min±2.2min内完全阻断小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉接头传递。膜片钳电生理实验显示,粗毒(1g/L)对蜚蠊背侧不成对中间(Dorsal unpaired median,DUM)神经元的快瞬时钾电流、钠电流、高电压激活的钙电流和大鼠背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)细胞延迟整流钾电流、TTX-S型钠电流、高电压激活的钙电流均无明显作用。

关键词：间斑寇蛛粗毒 LD50 酶生物学活性

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间斑寇蛛生活习性的初步观察

动物学杂志 2004年第1期39卷 85-88页

作者：陆东林张丹凤马德英乌鲁木齐奶业研究所乌鲁木齐830011 新疆农业大学乌鲁木齐830052

采用野外调查和室内饲养相结合的方法 ,观察研究了间斑寇蛛 (Latrotectustredecimguttatus)的生活习性和行为 ,介绍了对其生境、捕食、交配、产卵、孵化以及幼蛛成长、寿命等的观察结果 ,并对该蛛的互残行为、幼蛛饲养。

关键词：间斑寇蛛生活习性行为生活史

间斑寇蛛粗毒的采集、生物活性分析和蛋白质组学研究

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间斑寇蛛粗毒的采集、生物活性分析和蛋白质组学研究

作者：周红湖南师范大学

学位级别：硕士

间斑寇蛛(Latrodectus tredecimguttatus Rossi,1790)隶属于球蛛科的一种中型蜘蛛,又称黑寡妇蜘蛛,是目前世界上所知毒性最强的蜘蛛之一。本研究成功地对间斑寇蛛进行了室内人工饲养,并对间斑寇蛛的形态特征、生活习性与生态行为... 详细信息

间斑寇蛛(Latrodectus tredecimguttatus Rossi,1790)隶属于球蛛科的一种中型蜘蛛,又称黑寡妇蜘蛛,是目前世界上所知毒性最强的蜘蛛之一。本研究成功地对间斑寇蛛进行了室内人工饲养,并对间斑寇蛛的形态特征、生活习性与生态行为等进行了观察和分析,同时研究和探讨了温度、湿度和食物对间斑寇蛛活动能力、成活率和生殖力的影响。经统计分析,雌蛛平均体长10.037mm,体重0.475g;雄蛛平均体长4.58mm,体重0.104g。一头雌蛛平均可产卵袋4个,每个卵袋可孵出幼蛛200-300头。雌、雄幼蛛分别蜕皮6-7次和4次后变为成蛛。成蛛大多在入冬前死去。雄蛛寿命98-144天,雌蛛寿命130-300天。雌蛛与迟孵化约30天左右的雄蛛配对时,产卵率高于与同批孵化的雄蛛配对。间斑寇蛛幼蛛度过适当长度的“卵袋期”对于以后的成活与正常发育是必要的。在影响间斑寇蛛室内饲养效果的多种因素中,相对湿度是最重要的。间斑寇蛛生长发育的最适合温度为25℃,相对湿度为65%。通过对电刺激和分离毒囊等几种采毒方法的比较,发现电刺激是最佳的采毒方法。用反相高效液相色谱、质谱、双向电泳等方法对电刺激和分离毒囊得到的粗毒的的组成进行了比较研究。电刺激粗毒和分离毒囊得到的粗毒对小鼠腹腔注射的LD值分别为为0.393mg/kg和0.164 mg/kg。通过电生理实验发现该粗毒能

关键词：间斑寇蛛生态学人工饲养活体采毒生物学活性蛋白质组学分析

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间斑寇蛛幼蛛体内毒性成分的分离与活性分析

间斑寇蛛幼蛛体内毒性成分的分离与活性分析

作者：王素娥湖南师范大学

学位级别：硕士

间斑寇蛛（Latrodectus tredecimguttatus）俗称黑寡妇,是一种中型毒蜘蛛,在分类学上属于节肢动物门,蛛形纲,蜘蛛目,球蛛科,寇蛛属。间斑寇蛛是目前世界上发现的最毒的蜘蛛之一。在过去几十年里,国内外的相关工作者对间斑寇蛛毒腺分泌... 详细信息

间斑寇蛛（Latrodectus tredecimguttatus）俗称黑寡妇,是一种中型毒蜘蛛,在分类学上属于节肢动物门,蛛形纲,蜘蛛目,球蛛科,寇蛛属。间斑寇蛛是目前世界上发现的最毒的蜘蛛之一。在过去几十年里,国内外的相关工作者对间斑寇蛛毒腺分泌的毒素进行了较为详细的研究。然而,与其毒素只存在与毒腺中的蛇等动物不同,间斑寇蛛除毒腺中存在毒素外,身体的其他部位如腿和腹部也存在毒素,但到目前为止,还没有对其进行系统研究的报道。本论文对间斑寇蛛幼蛛体内的活性成分进行较为系统的提取、分离纯化和活性检测研究。Bradford法测得粗提物可溶性蛋白质的含量为27.72%。电生理实验表明粗提物能阻断小鼠膈神经-膈肌离体标本内的神经肌肉接头传递,粗提物浓度为80μg/ml时,完全阻断的时间为16 min。利用凝胶过滤层析,将粗提物进行分离,得到6个只要分离峰。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,粗提物中的高分子量蛋白质和低分子量成分得到了较好的分离。利用小鼠膈神经-膈肌标本进行的活性测定结果表明,分子量大于10kDa的凝胶过滤层析收集峰1号和2号能阻断小鼠离体膈神经-膈肌的神经肌肉接头传递。当加入终浓度为2.03mg/ml的收集峰1号成分后,完全阻断时间为16.0±1.5 min,用台式液漂洗不能消除其阻断效应;当加入终浓度为2.99 mg/ml的收集峰2号成分后,完全阻断时间为15.0±2.0 min,用台式液漂洗不能消除其阻断效应;用分子量小于10 kDa的进行电生理实验,不能完全阻断神经传递,即使浓度为5mg/ml时,也只能部分阻断膈神经-膈肌的神经传导,说明哺乳动物神经毒活性成分主要存在于分子量大于10kDa的样品中。

关键词：间斑寇蛛幼蛛毒性成分分离纯化活性分析

间斑寇蛛卵粒蛋白的分离纯化和结构与性质分析

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间斑寇蛛卵粒蛋白的分离纯化和结构与性质分析

作者：余海湖南师范大学

学位级别：硕士

间斑寇蛛（***）又名黑寡妇蜘蛛,是目前世界上已知毒性最强的蜘蛛之一。与其它有毒动物不同,间斑寇蛛除了毒腺中存在有毒成分外,其身体的其它部分（如腿、腹部组织等）甚至其卵粒和幼蛛体内也含有毒性成分。目前对间斑寇蛛卵粒毒素的研... 详细信息

间斑寇蛛（***）又名黑寡妇蜘蛛,是目前世界上已知毒性最强的蜘蛛之一。与其它有毒动物不同,间斑寇蛛除了毒腺中存在有毒成分外,其身体的其它部分（如腿、腹部组织等）甚至其卵粒和幼蛛体内也含有毒性成分。目前对间斑寇蛛卵粒毒素的研究已取得新的进展,本研究室综合利用生理、生化和蛋白质组学等技术对间斑寇蛛卵粒毒性的分子基础进行了分析,发现卵粒富含大分子量蛋白质,卵粒的毒性主要为其蛋白质成分所致;与毒腺毒液的蛋白质组成相比,卵粒的蛋白质组成更为复杂,两者的相似性很小,提示卵粒具有不同于毒腺毒液的毒理机制。同时,利用多种生化分离技术对卵粒中的蛋白质类成分进行了系统的分离纯化研究,已先后从卵粒提取物中分离得到了两种全新的毒素蛋白,分别命名为Latroeggtoxin-Ⅰ和-Ⅱ,并对其结构和功能进行了初步分析。为了进一步研究间斑寇蛛卵粒中的活性蛋白,探究卵粒毒性的分子机制,本研究综合利用凝胶过滤层析、离子交换层析和反相高效液相层析等生化分离技术对卵粒粗提物中的其他蛋白质成分进行分离纯化,并对得到的纯化蛋白进行结构和性质分析。间斑寇蛛卵粒经反复研磨和提取得到卵粒粗提物,然后通过凝胶过滤层析得到7个主要的分离峰（P1-P7）。初步的毒性实验提示1号峰（P1）含有毒性较强的成分,故本研究选择该峰进行进一步的分离。P1峰经DEAE阴离子交换柱层析得到5个主要分离峰（D1-D5）。然后利用基于C4柱的反相高效液相层析对主峰D4的成分进行进一步的脱盐和分离纯化,最终得到一个单一的蛋白质成分。SDS-PAGE分析表明该蛋白样品已达到电泳纯,蛋白质的分子量约为35 kDa。毒性分析发现,该蛋白在实验剂量下对小鼠没有明显的毒性作用,对离体小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉传导和大鼠背根神经节神经元上的钠、钾离子通道电流也无明显的影响,但对美洲蜚蠊具有较强的毒性作用,按10 μg/g剂量腹腔注射后,蜚蠊表现出明显的中毒症状,包括身体翻转、动作迟缓、反应迟钝等,并最终死亡。利用蜚蠊背侧不成对中间神经元进行膜片钳分析时,发现该蛋白对钾离子通道和钙离子通道电流具有一定的抑制作用。这些结果提示该蛋白可能是一种昆虫特异的毒素,命名为Latroeggtoxin-Ⅲ。Edman降解法测序结果显示,该蛋白 N 端的序列为 S-T-K-S-S-E-S-L-Y-L-E-A-L-Y-I-D-K-M-T-H-E-P-V-A-D—。利用该序列采用Mascot和BLAST软件进行序列搜寻和同源性分析,没有发现完全匹配的蛋白,证明Latroeggtoxin-Ⅲ是从间斑寇蛛卵粒中分离纯化的一种新型毒素蛋白。

关键词：间斑寇蛛卵粒毒素蛋白质纯化性质结构

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间斑寇蛛毒致急性肾损伤机制的研究

间斑寇蛛毒致急性肾损伤机制的研究

作者：石岩新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:通过间斑寇蛛毒致急性肾脏损伤的大鼠模型实验,观察肾损伤的病理形式、超微结构以及早期急性肾损伤发生的时间点,探讨间斑寇蛛毒素造成急性肾损伤机制,以指导临床治疗。方法:雄性SD大鼠随机分为生理盐水注射的对照组（n=32）、间... 详细信息

目的:通过间斑寇蛛毒致急性肾脏损伤的大鼠模型实验,观察肾损伤的病理形式、超微结构以及早期急性肾损伤发生的时间点,探讨间斑寇蛛毒素造成急性肾损伤机制,以指导临床治疗。方法:雄性SD大鼠随机分为生理盐水注射的对照组（n=32）、间斑寇蛛毒素（300μl/kg）注射的实验组（n=32）,在实验组有了明显中毒征象后,分别在0h、6h、12h、24h处死实验组及对照组大鼠,采集血液行全血生化分析,采集尿液行尿液分析,对肾脏组织行病理和透射电镜检查。结果:对肾脏组织行病理和透射电镜检查。结果实验组在6 h可见肾小囊及肾小管水肿的病理特征,12 h、24h时间点则进一步观察到肾小囊内大量出血,部分肾单位内肾小管上皮细胞脱落,脱落的上皮细胞核溶解,肾小管管壁正常结构消失。透射电镜在6h时明显观察到肾小球血管内壁有明显的复合物沉积,12h、24h时间点进一步观察到上皮细胞足突的消失,内质网吞噬体大量增加,滤过膜间隙增大,基膜及内皮细胞的脱落。对照组在0h、6h、12h、24h均未出现肾小囊及肾小管水肿,肾小囊内无出血,肾小管上皮细胞无脱落,肾小球血管内壁无复合物沉积,上皮细胞足突未消失,滤过膜间隙正常,基膜及内皮细胞无脱落。肾功各项指标尿素氮、尿酸、肌酐各实验浓度组与对照组大鼠比较无变化;对照组尿蛋白为阴性（-）,各剂量的实验组大鼠尿蛋白均为阳性（3+）,与对照组相比显著升高（P＜0.05）。结论:间斑寇蛛毒素可导致急性肾损伤甚至衰竭,中毒后的24h内逐渐加重,肾脏内的部分结构出现病理坏死的现象,且大鼠的尿蛋白会大量升高,这可能与肾组织溶解有关,然而尿酸、肌酐及电解质等各类指标正常,这可能由于24小时内还未累积到显著排泄功能变化。综上所述间斑寇蛛毒致急性肾损伤的发生时间较早,应及早进行干预治疗,避免出现不可逆的肾脏损伤。可为斑寇蛛毒致急性肾损伤的救治提供理论依据。

关键词：间斑寇蛛急性肾损伤组织病理超微结构