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猪流行性腹泻病毒感染小鼠血清抗体间接elisa方法的建立

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畜牧与兽医 2023年第7期55卷 64-68页

作者：李沛恒伊立超陈竞邹万成张国庆金宁一李昌吉林农业大学动物医学院吉林长春130122 中国农业科学院长春兽医研究所/中国医学科学院人兽共患病毒病防控关键技术研究创新单元吉林长春130122

为建立检测感染小鼠血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体的方法,本研究应用PEDV受体结合区(receptor binding domain, RBD)重组蛋白作为抗原,通过探索各反应的最佳条件,并进行了该方法灵敏度、重复性、特异性分析。结果显示,最佳蛋白包被... 详细信息

为建立检测感染小鼠血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体的方法,本研究应用PEDV受体结合区(receptor binding domain, RBD)重组蛋白作为抗原,通过探索各反应的最佳条件,并进行了该方法灵敏度、重复性、特异性分析。结果显示,最佳蛋白包被浓度为5μg/mL,待检血清稀释浓度为1∶400,孵育时间为37℃30 min,羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,孵育条件为37℃30 min,底物显色时间为15 min。对建立的elisa检测方法进行验证,阳性对照血清的稀释度为1∶204 800倍时OD450值仍大于临界值,批内和批间的变异系数均小于10%,对猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒抗体小鼠阳性血清检测均不发生交叉反应。结果表明本研究建立的小鼠血清PEDV抗体间接elisa方法具有很好的灵敏度、重复性、特异性。为PEDV候选疫苗的小鼠血清特异性抗体检测提供了一种精准、高效的方法。

关键词：猪流行性腹泻病毒受体结合区小鼠血清间接elisa方法

河南省猪细小病毒流行病学调查和猪细小病毒7型间接elisa方法的建立及应用

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河南省猪细小病毒流行病学调查和猪细小病毒7型间接ELISA方法的建...

作者：许夕雅河南农业大学

学位级别：硕士

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是细小病毒科中感染猪的多种细小病毒的统称,包括经典的猪细小病毒1型(PPV1),和近年来国内外相继发现的新型猪细小病毒——猪细小病毒2～7型(PPV2～PPV7),7种PPV被划分为4个不同的病毒属:PPV1为Proto... 详细信息

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是细小病毒科中感染猪的多种细小病毒的统称,包括经典的猪细小病毒1型(PPV1),和近年来国内外相继发现的新型猪细小病毒——猪细小病毒2～7型(PPV2～PPV7),7种PPV被划分为4个不同的病毒属:PPV1为Protoparvovirus,PPV2～PPV3为Tetraparvovirus,PPV4～PPV6为Copiparvovirus,PPV7为Chapparvovirus。为了解PPV1～PPV7的感染现状,本研究建立多重PCR方法对河南省猪临床样品进行检测分析;对感染率较高的PPV2、PPV7进行基因测序,分析其遗传进化特征;利用经典原核表达系统大肠杆菌BL21(DE3)表达了PPV7 Cap蛋白,建立间接elisa检测方法,为PPV7的血清学检测提供了支持。具体研究内容如下:***1/2/5三重PCR和PPV3/6/7三重PCR方法的建立本试验利用本实验室保存的PPV1/2/3/5/6/7阳性组织样品,提取核酸,制备标准阳性质粒,分别建立了针对PPV1/2/5、PPV3/6/7的三重PCR检测方法,优化后最佳结果为:PPV1/2/5三重PCR、PPV3/6/7三重PCR的最适退火温度分别为53℃、59℃;PPV1/2/5三重PCR最佳引物浓度分别为:0.8、0.2和0.4μmol/L,PPV3/6/7三重PCR最佳引物浓度分别为:0.4、0.4和0.2μmol/L;特异性试验表明,PPV1/2/5或PPV3/6/7与其他种PPV、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病病毒(PRV)均不发生交叉反应。PPV1/2/5三重PCR敏感性为10拷贝/μL,PPV3/6/7三重PCR敏感性为10拷贝/μL,与单一PCR一致。利用建立的多重PCR方法检测临床样品与单一PCR方法比对,符合率100%。结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法特异性强,符合率高,可以用于临床样品检测,为快速鉴定PPV1/2/3/5/6/7感染提供新的技术手段。2.2021～2022年河南省PPV流行病学调查本研究从河南省猪场2021?2022年送检样品中选取748份,利用试验一中建立的检测方法检测临床样品。结果显示,PPV2(16.04%)的感染率最高,PPV7(15.11%)次之。PPV1/2/3/5/6/7在河南省各地区一年四季广泛流行,秋冬季节是感染高峰期。产房仔猪未检出PPV1/3/5,PPV2/6/7可在各生长阶段猪群中检出,患呼吸系统疾病的保育和育肥猪中PPV各型检出率均较高,尤以PPV2常见。在不同类型样本中,PPV2和PPV7在口腔液、肺脾淋巴结中检出率均较高,血样中较低,PPV3常存在于血样和组织,PPV5常见于口腔液,PPV6常见于血样。PPV的混合感染现象严重且复杂,PPV2、PPV7可与其它PPV、PRRSV、PCV2混合感染,PPV7与PCV2混合感染最常见。本研究为进一步评估PPV感染和流行特征及临床危害性奠定基础。***2、PPV7分子流行病学调查本试验分别选取河南省不同地区4份PPV2和11份PPV7阳性样品,对PPV2全基因组、PPV7Cap基因测序,并与国内外参考序列进行同源性分析、系统发育分析和重组分析,了解河南省PPV2、PPV7的流行及遗传变异情况。结果显示,河南省PPV2流行株全基因组核苷酸同源性为94.0%～99.8%,处在不同进化分支,亲缘性较远,与35株PPV2参考毒株的全基因组核苷酸同源性为93.9%～99.8%,NS基因核苷酸及氨基酸同源性均为92.6%～99.8%,Cap基因核苷酸及氨基酸同源性均为88.7%～100%。PPV2ZMD-20/2021株、PPV2ZK-9/2021株、PPV2SQ-16/2021株可能为重组毒株。11株PPV7流行株Cap基因核苷酸同源性为90.2%～99.7%,氨基酸同源性为90.0%～99.8%,与45条参考序列的核苷酸及氨基酸同源性均为84.7%～99.4%。11株PPV7流行株在分支B、D、E、G均有分布,基因长度有1 425,1 422,1 410 bp 3种,542～556 bp处易缺失15 bp。由此得出,PPV2遗传进化差异较大,存在重组现象,且重组位置不唯一。PPV7 Cap基因差异较大,缺失和未缺失毒株均在河南省广泛流行。***7间接elisa方法的建立及应用本试验选择经典原核表达系统大肠杆菌BL21(DE3)表达了PPV7 Cap蛋白,作为包被抗原,建立了检测PPV7抗体的间接elisa方法,优化后反应条件为:抗原最佳包被浓度为2μg/m L,待检血清最佳稀释倍数为1:100,酶标二抗最佳稀释倍数为1:4 000,TMB最佳显色时间为

关键词：猪细小病毒1~7型三重PCR方法遗传进化分析间接elisa方法

应用间接elisa方法定量检测转基因抗虫玉米

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无锡轻工大学学报（食品与生物技术） 2003年第1期22卷 49-52,60页

作者：刘光明苏文金厦门大学生命科学学院

应用纯化的Bt1杀虫晶体蛋白质作为标准蛋白和免疫抗原 ,通过抗体抗原酶标抗体反应 ,建立了间接酶联免疫吸附测定法 (elisa) ,以快速检测转基因抗虫玉米中的Bt1表达蛋白 .用建立的elisa法对 4种进口玉米实物样品进行了测定 ,实验结... 详细信息

应用纯化的Bt1杀虫晶体蛋白质作为标准蛋白和免疫抗原 ,通过抗体抗原酶标抗体反应 ,建立了间接酶联免疫吸附测定法 (elisa) ,以快速检测转基因抗虫玉米中的Bt1表达蛋白 .用建立的elisa法对 4种进口玉米实物样品进行了测定 ,实验结果得到了免疫印迹分析的验证。

关键词：间接elisa方法检测转基因玉米杀虫蛋白转基因食品

不同包被抗原检测PRRS抗体间接elisa方法的建立

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中国兽医学报 2018年第6期38卷 1082-1087页

作者：马思续崔春晓张留君冯延魏凤灵许瑞勤杨国宇夏平安张改平河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 汤阴县产品质量检验检测中心河南安阳456150

为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体的间接elisa方法，本研究利用RT—PCR方法分别扩增出PRRSVVR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因，将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中，... 详细信息

为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体的间接elisa方法，本研究利用RT—PCR方法分别扩增出PRRSVVR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因，将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中，成功构建重组质粒pET32a—GP4、pET-32a-N和pET-32a—GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4N融合蛋白，并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接elisa的包被抗原，通过不断优化反应条件，最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接elisa方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体，并与商品化试剂盒进行比较，结果显示，GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82．7％，N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87．2％，GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85．5％；因此，N蛋白是间接elisa方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP4蛋白 N蛋白原核表达间接elisa方法

新型鸭细小病毒重组VP2蛋白的原核表达及其间接elisa方法的建立

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黑龙江畜牧兽医 2021年第5期 85-91页

作者：刘铭袁万哲刘聚祥河北农业大学动物医学院河北保定071000

为了建立新型鸭细小病毒(novel duck Parvovirus, NDPV)感染鸭群的抗体检测方法,试验采用PCR方法扩增新型鸭细小病毒的VP2基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,获得重组质粒pET-32a(+)-VP2;将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经... 详细信息

为了建立新型鸭细小病毒(novel duck Parvovirus, NDPV)感染鸭群的抗体检测方法,试验采用PCR方法扩增新型鸭细小病毒的VP2基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,获得重组质粒pET-32a(+)-VP2;将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经优化诱导表达后通过SDS-PAGE电泳分析表达产物,并对表达的蛋白质进行纯化、复性;再利用阳性血清对表达的蛋白质进行Western-blot鉴定;以纯化的重组蛋白作为抗原包被elisa酶标板,通过优化抗原包被量、一抗稀释度、抗原封闭条件、一抗和二抗的孵育条件等最终建立间接elisa方法,并对该方法进行评定。结果表明:成功构建出NDPV重组VP2蛋白,在37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导5 h的表达量最大,蛋白质的分子质量约为49 ku,主要以不溶性的包涵体形式存在。纯化、复性后的重组VP2蛋白浓度为2.378 mg/mL,纯度为97%。Western-blot鉴定得到的条带单一,大小为49 ku。间接elisa检测方法的最佳抗原包被量为200 ng/孔,一抗稀释度为1∶200;其他检测条件最优结果为4℃包被过夜,37℃封闭2 h,一抗37℃孵育1 h,二抗稀释10 000倍,二抗37℃孵育1 h。间接elisa检测方法的检测临界值为0.445,该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,对临床样品的阳性检出率为93.3%。说明以重组VP2蛋白为包被抗原建立的间接elisa检测方法效果良好,为临床NDPV的感染提供了一种新的检测方法。

关键词：新型鸭细小病毒原核表达重组VP2蛋白 Western-blot 间接elisa方法