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间接原位pcr检测实验性弓形虫感染病理标本

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寄生虫与医学昆虫学报 2000年第2期7卷 65-69页

作者：李爽甘绍伯彭瑞云高亚兵熊呈琦北京热带医学研究所北京1000502 军事医学科学院放射医学研究所北京100850

探讨间接法原位 pcr在弓形虫感染病原学检测中的应用。以 RH株弓形虫速殖子感染小鼠后第 2、4、6天处死 ,取肝脏制备石蜡标本及冰冻切片标本 ,以间接法原位 pcr扩增并检测石蜡标本中的弓形虫 DN A,与原位杂交方法检测冰冻切片标本的结... 详细信息

探讨间接法原位 pcr在弓形虫感染病原学检测中的应用。以 RH株弓形虫速殖子感染小鼠后第 2、4、6天处死 ,取肝脏制备石蜡标本及冰冻切片标本 ,以间接法原位 pcr扩增并检测石蜡标本中的弓形虫 DN A,与原位杂交方法检测冰冻切片标本的结果比较。以间接原位 pcr方法检测 18例标本均得到阳性信号 ,病原体检出率为 10 0 % ,优于原位杂交法 ( 9/18)。间接法原位

关键词：弓形虫病理检测间接原位pcr 诊断

海豚链球菌cpsD基因的克隆、原核表达及基于cpsD基因的间接原位pcr方法的建立

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海豚链球菌cpsD基因的克隆、原核表达及基于cpsD基因的间接原位PC...

作者：王浩丞四川农业大学

学位级别：硕士

从1976年海豚链球菌首次从淡水海豚上分离报道以来,其不但逐渐成为危害世界水产养殖业的主要病原菌,而且近年来关于海豚链球菌感染人的报道时有可见,海豚链球菌病成为了一种世界范围内的人和鱼类的共患疾病,引起了越来越多的人对该菌的... 详细信息

从1976年海豚链球菌首次从淡水海豚上分离报道以来,其不但逐渐成为危害世界水产养殖业的主要病原菌,而且近年来关于海豚链球菌感染人的报道时有可见,海豚链球菌病成为了一种世界范围内的人和鱼类的共患疾病,引起了越来越多的人对该菌的关注和研究。本研究对分离自患病斑点叉尾鮰的海豚链球菌DGX07菌株(GenBank登录号为FJ951434),运用分子生物学方法开展该致病菌的功能基因cpsD的分子特性、原核表达及其在间接原位pcr检测方法的研究,旨在为进一步开展海豚链球菌cpsD基因的功能等研究提供基础实验数据,并为病原菌的分子生物学特性研究、致病机理等提供指导性意义,从而为海豚链球菌的疫苗的发展奠定坚实的基础。1.海豚链球菌链球菌cpsD基因的克隆、鉴定及分子特性分析对海豚链球菌分离株DGX07cpsD基因进行克隆和鉴定,运用生物信息学软件对cpsD基因进行分子特性分析。结果显示：海豚链球菌分离株cpsD基因大小为720bp,为一个完整ORF,编码239个氨基酸,具有1个三磷酸核苷酸水解酶的保守结构域;该推导氨基酸序列具有高度保守性,与其它海豚链球菌菌株的相似性为100%;编码多肽链中疏水区多于亲水区,不含有跨膜区和信号肽,具有潜在的磷酸化位点多达22个,潜在的糖基化位点1个。密码子偏爱性分析结果显示：海豚链球菌cpsD基因偏爱第三位碱基为T或者A碱基的密码子,与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用频率差异分别有33、26和31个。2.海豚链球菌cpsD基因的原核表达和多克隆抗体的制备构建重组表达质粒pET-32a(+)-cpsD,转化到大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS,使用IPTG诱导cpsD基因的原核表达。经SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的大小约46KDa,表达产物主要以包涵体的形式存在;最佳表达条件为0.6mmol/LIPTG终浓度在37℃下诱导5h。利用纯化的重组蛋白免疫家兔,制备了海豚链球菌CpsD多克隆抗体。Western Blot检测显示CpsD重组蛋白具有良好的反应原性;琼脂扩散试验分析显示制备的兔抗CpsD重组蛋白多克隆抗体的免疫效价达1：16。3.间接原位pcr检测海豚链球菌感染斑点叉尾鮰组织分布以海豚链球菌分离株DGX07菌株LD5o剂量腹腔注射斑点叉尾鮰,设计海豚链球菌cpsD基因特异性引物和寡核苷酸探针并建立间接原位pcr方法研究海豚链球菌在感染斑点叉尾鮰组织细胞的分布规律。结果表明：感染后4h时,在斑点叉尾鮰的肝脏和脾脏中首先检测到少量的阳性信号;感染后8h时,在斑点叉尾鮰的肾脏开始检测到阳性信号;感染后24h时,在鳃、心、眼球和脑组织检测到阳性信号,在肝脏、脾脏、肾脏可检测大量阳性信号分布。

关键词：海豚链球菌 cpsD基因克隆分子特性分析原核表达间接原位pcr

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应用间接原位pcr诊断弓形虫淋巴结炎

江苏大学学报（医学版） 2008年第1期18卷 70-72,I0002页

作者：卢慎江苏大学附属昆山医院实验室江苏昆山215300

目的:探讨间接原位pcr技术在弓形虫淋巴结炎病理诊断中的应用。方法:设计弓形虫B1基因1对引物进行原位扩增,选择弓形虫B1基因来源的地高辛标记探针进行扩增后原位杂交,应用间接原位pcr技术,检测三所医院共86例病理诊断为慢性非特异性淋... 详细信息

目的:探讨间接原位pcr技术在弓形虫淋巴结炎病理诊断中的应用。方法:设计弓形虫B1基因1对引物进行原位扩增,选择弓形虫B1基因来源的地高辛标记探针进行扩增后原位杂交,应用间接原位pcr技术,检测三所医院共86例病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎石蜡包埋切片组织中的弓形虫。结果:86例中47例弓形虫阳性,占54.65%。三所医院弓形虫阳性率经统计学处理无显著性差异(P>0.05)。结论:在病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎病例中,存在被误诊的弓形虫淋巴结炎病例。

关键词：弓形虫淋巴结炎间接原位pcr

应用免疫组化、原位杂交及间接原位pcr诊断弓形虫淋巴结炎

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中国实验诊断学 2008年第10期12卷 1305-1307页

作者：卢慎昆山市第一人民医院江苏大学附属昆山医院实验室江苏昆山215300

目的研究弓形虫淋巴结炎的病理诊断。方法应用免疫组化、原位杂交及间接原位pcr技术,检测71例病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎(淋巴结反应性增生)组织切片中的弓形虫。结果在71例中应用免疫组化、原位杂交及间接原位pcr技术检测,弓形虫... 详细信息

目的研究弓形虫淋巴结炎的病理诊断。方法应用免疫组化、原位杂交及间接原位pcr技术,检测71例病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎(淋巴结反应性增生)组织切片中的弓形虫。结果在71例中应用免疫组化、原位杂交及间接原位pcr技术检测,弓形虫阳性病例分别为17例(23.94%)、35例(49.30%)、41例(57.75%),经统计学处理有显著差异(P原位杂交及间接原位pcr均能显示淋巴结组织切片中的弓形虫,但弓形虫检测结果阳性率依次为间接原位pcr、原位杂交及免疫组化。

关键词：弓形虫淋巴结免疫组化原位杂交间接原位pcr

轮状病毒腹泻患儿病毒血症和肠道外脏器感染的研究(英文)

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第一军医大学学报 2003年第7期23卷 643-648页

作者：李宁姚英民王志远第一军医大学南方医院儿科第一军医大学南方医院儿科广东广州510515 第一军医大学医工系

目的探讨轮状病毒(RV)腹泻患儿是否会发生病毒血症,以及RV是否能感染肠道外脏器。方法以套式RT-pcr方法检测全部60例RV腹泻患儿的血浆标本和其中14例单个核细胞中的RV基因;以原位杂交和原位RT-pcr方法检测2例伴有RV感染的死亡患儿各脏... 详细信息

目的探讨轮状病毒(RV)腹泻患儿是否会发生病毒血症,以及RV是否能感染肠道外脏器。方法以套式RT-pcr方法检测全部60例RV腹泻患儿的血浆标本和其中14例单个核细胞中的RV基因;以原位杂交和原位RT-pcr方法检测2例伴有RV感染的死亡患儿各脏器中的RV基因。结果从60例患儿中检测到病毒血症4例:1例血浆中检测到RV阳性,其pcr产物部分测序结果证实属RV序列,血清型III,未见变异;14例单个核细胞中检测到3例阳性,其相应的血浆标本RV阴性。从2例死亡患儿的小肠、肝脏、肺、肾脏中检测到RV基因。结论普通RV腹泻患儿可出现病毒血症,RV可以从肠道向其他脏器扩散,病毒血证实其扩散途径。

关键词：轮状病毒腹泻病毒血症肠道外脏器感染儿童间接原位pcr 原位杂交

小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠和雏鹅体内动态分布规律的研究

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小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠和雏鹅体内动态分布规律的研究

作者：李万奎四川农业大学

学位级别：硕士

本研究根据GenBank中鹅细小病毒VP3基因序列,应用Oligo软件设计一对引物,液相pcr扩增出了预期长度为441bp的片段;另外在扩增片段范围内,应用Oligo软件设计一段34bp的寡核苷酸探针,5’端用地高辛标记,建立了能特异从免疫小鼠和雏鹅组织... 详细信息

本研究根据GenBank中鹅细小病毒VP3基因序列,应用Oligo软件设计一对引物,液相pcr扩增出了预期长度为441bp的片段;另外在扩增片段范围内,应用Oligo软件设计一段34bp的寡核苷酸探针,5’端用地高辛标记,建立了能特异从免疫小鼠和雏鹅组织石蜡切片中检测出pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗的原位杂交和间接原位pcr方法。将pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗分别以200μg、100μg、50μg肌肉注射和6μg、3μg、1μg基因枪轰击的方法免疫BALB/C小鼠和30日龄雏鹅,并设置生理盐水和空白载体为对照组,免疫后不同时间分别取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠、脑和免疫部位（皮肤或肌肉）和雏鹅的心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、胸腺、哈氏腺、十二指肠、空肠、盲肠、直肠、胰腺、脑和免疫部位（皮肤或肌肉）等组织;通过建立的原位杂交和间接原位pcr方法检测pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗在小鼠和雏鹅体内的动态分布规律和组织定位特点。结果表明: 1.建立的原位杂交和间接原位pcr方法特异性强、灵敏度高、定位准确,斑点杂交结果显示,所设计的寡核苷酸探针可检测约13pg的同源DNA。 2.应用建立的原位杂交检测pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗在小鼠和雏鹅体内的分布规律:pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗能快速而广泛分布于小鼠和雏鹅各个组织,各剂量肌肉注射和基因枪轰击后1h即可在除脑各组织中检测到pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗,免疫后3h小鼠和雏鹅脑组织呈阳性;pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗在各组织中持续时间存在差异,肌注组在肌肉组织中存留时间最长,为105d,其次为肝脏63d,而基因枪轰击组在肝脏组织中存留时间最长,雏鹅组达133d,而小鼠组为63d,脾脏和心脏次之,分别为63d和49d,脑组织中持续时间最短,小鼠仅持续7d,而雏鹅大剂量组仅持续49d,雏鹅各肠段持续时间无明显差异。 3.pcDNA-GPV-VP3基因疫苗信号强弱和持续时间存在的总体规律为:6μg组＞3μg组＞1μg组,200μg组＞100μg组＞50μg组,说明基因疫苗免疫剂量和分布规律有一定的正相关性。 4.肌肉注射和基因枪轰击都是pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗的良好免疫途径,但基因枪轰击基因疫苗剂量更少,然而在被免疫的小鼠和雏鹅体内也能快速而广泛的分布,在雏鹅法氏囊和哈德氏腺中持续时间反而比肌肉注射途径更长,信号也更强,说明基因枪轰击优于肌肉注射免疫途径。 5.原位杂交检测pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗在动物组织中的定位规律:原位杂交结果显示,pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗于免疫1h后各组织阳性信号位于细胞核和细胞浆,而免疫3h后主要位于细胞核,少数细胞浆呈阳性,随着时间的推移,各组织阳性信号逐渐减弱;阳性信号主要分布在肝细胞和枯否氏细胞,脾脏弥散性分布有阳性细胞,肠黏膜上皮细胞、杯状细胞和肠腺细胞,肺泡上皮细胞,肾脏肾小管,胸腺髓质和皮质,法氏囊髓质;各个组织信号强度存在差异,总的看来,肝脏、心脏、脾脏和注射部位肌肉组织信号较强,肾脏和肠组织次之,脑组织信号最弱,雏鹅各肠段分布规律和信号强弱无明显差异。 6.间接原位pcr比原位杂交灵敏度高,检测到的pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗在免疫小鼠和雏鹅体内持续时间更长,且检测到的杂交信号也更强。

关键词：原位杂交间接原位pcr pcDNA-GPV-SC-VP3基因疫苗小鼠雏鹅动态分布规律

家兔无乳链球菌的分离鉴定及其感染的动态病理学与病原分布研究

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家兔无乳链球菌的分离鉴定及其感染的动态病理学与病原分布研究

作者：任思宇四川农业大学

学位级别：硕士

2011年7月四川绵阳某家兔养殖场爆发了以四肢麻痹、划游和呼吸障碍为特征的疾病,死亡率达42%;从患病家兔肝、肺、脑和心血中分离到一株链状革兰氏阳性球菌(P110323),以浓度为1×106CFU/mL的P110323菌株培养液灌胃感染健康家兔,家兔出现... 详细信息

2011年7月四川绵阳某家兔养殖场爆发了以四肢麻痹、划游和呼吸障碍为特征的疾病,死亡率达42%;从患病家兔肝、肺、脑和心血中分离到一株链状革兰氏阳性球菌(P110323),以浓度为1×106CFU/mL的P110323菌株培养液灌胃感染健康家兔,家兔出现站立不稳、四肢划动、惊厥和呼吸障碍等症状,并逐渐死亡;解剖可见肺淤血、出血;肝、脾和肾肿大,坏死;大脑肿胀,脑膜充血,脑回肿胀扁平,脑沟变浅。P110323在BHI平板上形成湿润、边缘整齐的灰白色菌落,在5%的脱纤维羊血平板上形成透明的p溶血环,V-P试验、水解精氨酸与马脲酸等为阳性;水解七叶苷和利用甘露醇、山梨醇产酸为阴性。药物敏感性实验结果显示氨苄西林、庆大霉素、氟哌酸、奥复星、复达欣和氟苯尼考对P110323有效,四环素、强力霉素的抑制作用为中介;青霉素,链霉素,阿莫西林、丁胺卡娜及妥布霉素对其无效。16S rDNA系统发育分析显示分离菌与Streptococcus difficilis和Streptococcus agalactiae聚在一簇;gyrB基因系统发育分析表明分离菌属于无乳链球菌(S. agalactiae).结合细菌形态特点和生理生化特性,鉴定该P110323为无乳链球菌(S. agalactiae),多重pcr方法确定该菌荚膜多糖类型为la型。采用灌胃接种的感染方式建立S. agalactiae人工感染家兔的病理模型,观察和记录家兔感染后的临床症状,并在接种后的0h,6h,12h，18h,24h,48h,72h,96h......10d时间点,随机抽取试验组和对照组家兔各2只,腹腔注射过量的戊巴比妥让其死亡,解剖后取脑、心、肝、脾、肾、肺等重要的组织器官进行组织病理学、超微病理学研究,同时建立基于无乳链球菌cfb基因的间接原位pcr检测方法研究无乳链球菌感染家兔后的侵染规律。结果表明S. agalactiae主要引起胃、肺、肝、脾、肾、小脑等组织的损伤,并导致家兔体内发生弥散性血管内凝血(Disseminated intravascular coagulation, DIC),引起死亡。接种6h后,在胃组织中检测出S. agalactiae,引起胃组织充血,黏膜上皮坏死、脱落;12h在脾和肺中检测到S. agalactiae,脾可见巨噬细胞增多和淋巴细胞减少,随着病情发展,脾出现弥漫性坏死,细胞结构模糊不清;肺在感染初期表现为充血、出血,大量巨噬细胞出现在肺泡腔内,后期在肺泡隔的小血管中形成微血栓;24h在肝和肾中出现阳性信号,S. agalactiae主要引起肝淤血、肝细胞颗粒变性及溶解坏死,并逐渐在门管区血管中形成血栓;肾主要表现为肾小管上皮细胞坏死脱落,肾小球毛细血管中形成透明血栓;2d后在心肌和小脑中检测到阳性信号,心肌肌纤维胞浆浓缩,逐步演变为肌纤维的断裂坏死;小脑中S. agalactiae主要集中在分子层,引起神经细胞的溶解坏死,神经元髓鞘结构增厚。

关键词：无乳链球菌家兔病理形态学侵染规律间接原位pcr

无乳链球菌cpsE基因的克隆、原核表达和多克隆抗体制备及其在原位pcr中的应用

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无乳链球菌cpsE基因的克隆、原核表达和多克隆抗体制备及其在原位...

作者：付希四川农业大学

学位级别：硕士

本研究以收集自海南文昌市多个养殖场感染无乳链球菌病的罗非鱼为研究对象,应用分子生物学手段研究了致病菌功能基因cpsE的分子特性、原核表达及其在间接原位pcr检测方法方面的应用,旨在为进一步开展无乳链球菌cpsE基因的功能等研究提... 详细信息

本研究以收集自海南文昌市多个养殖场感染无乳链球菌病的罗非鱼为研究对象,应用分子生物学手段研究了致病菌功能基因cpsE的分子特性、原核表达及其在间接原位pcr检测方法方面的应用,旨在为进一步开展无乳链球菌cpsE基因的功能等研究提供全面的基础实验数据,并为以无乳链球菌功能基因重组蛋白为主要抗原成分的新型渔用疫苗的研发奠定理论基础。 1.无乳链球菌cpsE基因的分子特性分析利用生物信息学软件对cpsE扩增序列进行分子特性分析。结果显示,无乳链球菌分离株cpsE基因推导氨基酸序列具有高度保守性,与人源、动物源无乳链球菌相似性达100%;序列中Lys和Val含量最高,分别为10.7%和10.1%;推导序列第56和第142个氨基酸残基之间含有1个糖基转移酶超家族的保守结构域,具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点3个,编码多肽链中亲水区大于疏水区,含有跨膜区,无信号肽序列;二级结构中,α-螺旋占的比例最大,达40.94%,其次为β-折叠25.50%,p-转角5.37%和无规则卷曲28.19%。密码子偏爱性分析结果显示,无乳链球菌cpsE基因偏爱GCA等23个密码子,与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用偏爱性差异较大的分别有20、18和24个;稀有密码子分析显示,cpsE基因开放阅读框的密码子利用情况与大肠杆菌无明显差异。 2.无乳链球菌cpsE基因的原核表达和多克隆抗体的制备构建重组表达质粒pET-32a（+）-cpsE,并转入大肠杆菌BL21（DE3）进行原核表达,再利用SDS-PAGE. Western-blot及琼脂扩散试验对重组蛋白的免疫原性进行研究。结果显示,使用IPTG为表达诱导剂,在菌体经超声波破碎处理的沉淀成分中可检测到一种大小约36KDa的蛋白,与cpsE基因表达产物的预期大小相吻合。对表达条件进行优化后显示,最佳表达条件为0.2mM的IPTG在37℃下诱导3h。利用重组表达蛋白所带的6×His标签使用亲和层析的方法对其进行纯化,能获取较高纯度的重组蛋白。将过柱纯化的重组蛋白免疫家兔,制备了兔的高免血清。经VVestern-blot和琼脂扩散试验检测结果表示,CpsE重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔抗CpsE重组蛋白多克隆抗体的免疫效价达1：32。 3.基于cpsE基因的间接原位pcr方法的建立与应用通过腹腔注射无乳链球菌分离株活菌液、无乳链球菌标准菌株活菌液和生理盐水的方式,制备小鼠人工感染阳性对照样品、待检样品和阴性对照样品。以无乳链球菌cpsE基因为模板设计特异性引物和寡核苷酸探针,应用于已制备的阳性对照样品和阴性对照样品上进行间接原位pcr方法的构建,并以建立的间接原位pcr方法检测待检样品,研究无乳链球菌分离株在小鼠体内组织的分布规律。结果表明,人工感染4h时,在小鼠的肝脏和肾脏检测到少量的阳性信号;人工感染后8h时,在小鼠的脾脏和肺脏也开始检测到阳性信号;人工感染后12h时,在小鼠的胃和肠部位也检测到强阳性信号;人工感染后24h和36h时,在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、脑、肠和肺脏都可检测到大量阳性信号分布,但心肌中始终只有少量阳性信号分布。

关键词：无乳链球菌 cpsE基因克隆分子特性原核表达间接原位pcr

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应用3种方法诊断弓形虫淋巴结炎

世界感染杂志 2008年第5期8卷 375-378页

作者：卢慎昆山市第一人民医院江苏大学附属昆山医院实验室江苏昆山215300

目的探讨研究弓形虫淋巴结炎的病理诊断。方法应用免疫组化、原位杂交及间接原位pcr技术，检测71例（均来自可疑弓形虫感染者）经病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎（淋巴结反应性增生）病人组织切片中的弓形虫。结果发现在71例中弓形虫... 详细信息

目的探讨研究弓形虫淋巴结炎的病理诊断。方法应用免疫组化、原位杂交及间接原位pcr技术，检测71例（均来自可疑弓形虫感染者）经病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎（淋巴结反应性增生）病人组织切片中的弓形虫。结果发现在71例中弓形虫阳性病例分别为17例（23．94％）、35例（49．30％）、41例（57．75％），免疫组化与原位杂交、间接原位pcr结果差异有统计学意义（P〈0．005）。结论在病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎（淋巴结反应性增生）的病人中，部分为漏诊的弓形虫淋巴结炎病例。免疫组化、原位杂交及间接原位pcr均能显示淋巴结组织切片中的弓形虫，但弓形虫检测结果阳性率从高到低依次为间接原位pcr、原位杂交及免疫组化。

关键词：弓形虫淋巴结免疫组化原位杂交间接原位pcr