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检索条件"主题词=间充质干细胞系C3H/10T1/2细胞"

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cKIP-1对c3h/10t1/2细胞成骨分化和免疫调控功能的影响研究

CKIP-1对C3H/10T1/2细胞成骨分化和免疫调控功能的影响研究

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作者：陈俊凤中国人民解放军医学院

学位级别：硕士

间充质干细胞(MScs)存在于几乎所有的组织中,是能自我更新的多潜能干细胞,其较强的成骨分化能力、免疫调节能力和治疗多种炎症相关疾病的潜能近来受到广泛关注,但其调控机制仍不清楚。cKIP-1是一种骨形成负调节子,与MScs成骨分化的多种... 详细信息

间充质干细胞(MScs)存在于几乎所有的组织中,是能自我更新的多潜能干细胞,其较强的成骨分化能力、免疫调节能力和治疗多种炎症相关疾病的潜能近来受到广泛关注,但其调控机制仍不清楚。cKIP-1是一种骨形成负调节子,与MScs成骨分化的多种蛋白相互作用,且与促炎因子mtNF相互作用,LPS刺激下在thP-1单核细胞模型中表达显著上调。而同样具有成骨分化和免疫功能的MScs又是如何受cKIP-1调控,目前尚不清楚。研究cKIP-1在MScs成骨分化和免疫调控的机制对其临床应用有重要的意义。目的:研究cKIP-1在MScs细胞系c3h/10t1/2成骨分化和免疫调控的机制方法:第一部分:cKIP-1调控c3h/10t1/2细胞成骨分化对贴壁培养的小鼠c3h/10t1/2细胞成骨诱导不同时间,ALP染色及Rt-qPcR验证诱导结果,同时观察cKIP-1及miR-20a在诱导过程中表达变化。cKIP-1 siRNA和miR-20a用Lipo3000脂质体转染,荧光显微镜下观察转染效果,Rt-qPcR测定干扰或过表达效率及成骨标记基因表达。第二部分:cKIP-1调控c3h/10t1/2细胞免疫调节功能qRt-PcR及Western blot检测细胞在LPS刺激下cKIP-1 mRNA和蛋白水平表达变化。利用带有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒感染c3h/10t1/2细胞系,建立cKIP-1干扰的MScs,并进行干扰效率检测(转染空载体细胞写作sh-ctrl,转染cKIP-1干扰序列的细胞写作sh-cKIP-1),并检测cKIP-1敲低对细胞免疫表型及细胞周期的影响。t细胞用cFSE染色并与不同比率c3h/10t1/2共培养,细胞流式检测sh-ctr和sh-cKIP-1对t细胞增殖抑制的差异。Rt-qPcR检测炎性条件下,cKIP-1敲低对免疫相关因子tNF-α,IFN-γ,IL-10及p38 MAPK表达的影响。高糖环境下Rt-qPcR检测cKIP-1、抗炎因子IL-10表达变化;细胞流式检测c3h/10t1/2对t增殖的抑制作用。结果:第一部分:cKIP-1调控c3h/I0tl/2细胞成骨分化1.成骨标记基因ALP、OSX、OcN、BSP随小鼠c3h/10tl/2细胞诱导过程逐渐升高,且成骨诱导分化过程中cKIP-1表达下调,miR-20a表达上调。***干扰cKIP-1促进细胞成骨标记基因表达。3.过表达miR-20a抑制cKIP-1的表达,促进c3h/10t1 /2细胞成骨分化。第二部分:cKIP-1调控c3h/10t1/2细胞免疫调节功能1.使用慢病毒成功干扰了c3h/10t1/2细胞中的cKIP-I表达,cKIP-1敲低不影响细胞的形态,表型及细胞周期。2.小鼠c3h/10t1/2细胞中cKIP-1水平随着LPS刺激的时间和刺激强度的增加而增加,表现为刺激时间和刺激强度依赖性。3 .sh-ctrl和sh-cKIP-1表现出相似的炎性刺激后反应。4.c3h/10tI/2与t细胞共培养实验证实了 sh-cKIP-1具有比sh-ctrl更强的抑制t细胞增殖的能力。5. LPS的刺激下,sh-cKIP-1比sh-ctrl有更高的抗炎因子IL-10的表达,tNF-α,IFN-γ的水平无明显差异,且cKIP-1敲低后p38信号通路的磷酸化更加显著。6.高糖环境抑制cKIP-1 mRNA水平,提高了细胞的免疫抑制能力及抗炎因子IL-10表达水平。结论:cKIP-1在小鼠c3h/10t1/2细胞成骨分化和免疫调控中发挥重要的作用。cKIP-1参与MScs的成骨分化可能是受miR-20a的调控,从而抑制成骨作用。MScs中的cKIP-1能被LPS所诱导表达,cKIP-1干扰未造成c3h/10t1/2细胞表型、细胞周期的明显差别,但增强其免疫抑制能力,且促进抗炎因子IL-10及p38的活化。高糖环境下cKIP-1表达降低,但细胞免疫抑制能力及抗炎因子IL-10表达增强,这与cKIP-1干扰表达结果相似。

关键词： cKIP-1 间充质干细胞系c3h/10t1/2细胞成骨分化免疫调节高糖

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