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基于表面电荷可控荧光蛋白在构建智能响应型载体的应用

基于表面电荷可控荧光蛋白在构建智能响应型载体的应用

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作者：赵崑荔湖南大学

学位级别：硕士

基因转导是将目的基因导入靶细胞内,然后释放目的基因,使得目的基因进行表达,从而达到治疗特定疾病的目的。基因转导在广泛基因的结构功能分析,基因的调控表达,基因治疗及基因改造等方面有着广泛的应用等。尽管有很多的转染体系已经发... 详细信息

基因转导是将目的基因导入靶细胞内,然后释放目的基因,使得目的基因进行表达,从而达到治疗特定疾病的目的。基因转导在广泛基因的结构功能分析,基因的调控表达,基因治疗及基因改造等方面有着广泛的应用等。尽管有很多的转染体系已经发展为有效的商业试剂,但存在免疫反应,细胞毒性,稳定性及非智能型响应等问题。因此设计出能根据外界环境刺激与核酸自组装的载体,如pH响应和离子响应型,是十分有必要的。最近,对ScGFP表面进行重构发展出一种表面含有39组氨酸残基的新型超电荷荧光蛋白（H39GFP）。H39GFP表面上组氨酸残基有其独特的化学性质,如pH依赖的电离或接受质子的性质,以及螯合金属离子的能力。因此,我们设想通过pH和金属离子调控H39GFP的表面电荷,使H39GFP能像ScGFP 一样表面呈正电性,从而运载核酸进入细胞内。因此,本文尝试将H39GFP发展为一种外界刺激响应型载体,主要研究内容如下:（1）相对于正常生理条件（pH为7.0-7.4）,肿瘤的微环境处于弱酸条件（pH为5.7-7.0）。组氨酸残基中咪唑基团的pKa为6.10,当溶液的pH为6.0时,理论上H39GFP,所带电荷为+26。此外,基团咪唑与金属离子配位也可使H39GFP表面呈正电性。动态光散射技术,测得H39GFP在弱酸性、Ni2+存在时的Zeta电位分别为4.56± 0.45 mV 和 6.69± 1.16 mV,而 pH 为 7.4 时 H39GFP 的 Zeta 为 1.72 ± 0.24 mv。上述实验结果表明在弱酸或镍离子条件能使H39GFP带大量正电。并通过原子力显微镜证明带大量正电的H39GFP能和核酸形成高为35-70 nm的复合物,而在pH为7.0条件下,H39GFP与核酸的高度仅有5nm,说明H39GFP只有在带大量正电时,可以与核酸结合,同时用带有荧光基团的核酸,通过激光共聚焦显微镜成像支持该结论。证实了在不同刺激下H39GFP可以和核酸自组装。（2）根据H39GFP表面的变化,我们利用微环境变化作为类似激活剂物质去实现“或”和“与”逻辑门的构建。我们将pH的变化和镍离子的存在作为输入条件,H39GFP（或DNA）进入细胞情况作为输出信息,构建出“或”逻辑门。通过激光共聚焦显微成像及流式细胞仪可知,在仅满足一个条件时,H39GFP（DNA）就能进入细胞,完全符合“或”逻辑门。另外,我们还通过定义DNA的加入及镍离子的存在为输入信息,DNA进入细胞情况作为输出信息,构建出“与”逻辑门。并通过激光共聚焦成像可知,当且仅当DNA及镍离子都加入的条件下,DNA才能进入细胞,符合“和”逻辑门。基于以上结果,我们发现在pH6.0条件时,H39GFP能将siRNA带进细胞,在48小时后,通过免疫印迹实验证明,siRNA能很好的干扰目标蛋白β-actin,并达到48%干扰效率,证实了 H39GFP作为核酸载体能保持核酸的相关功能。（3）基于H39GFP作为载体,我们还构建了 ATP响应型的药物释放体系,来提高抗癌药物的释放效率。这里我们利用三磷酸腺苷（ATP）作为引发剂来可控释放抗癌药物。由于其功能化加入了 ATP的核酸适配体,因此可以在ATP浓度较大的环境中,改变构象从而释放已插入DNA的药物阿霉素（Dox）。我们通过流式细胞仪及细胞毒性实验,发现单独的ATP-Duplex/Dox无法进入细胞,并释放Dox,而有H39GFP作为载体时,ATP-Duplex/Dox能很好地进入细胞,证实了 H39GFP/ATP-Duplex/Dox能很好进入细胞并释放药物。

关键词： H39GFP 核酸载体纳米复合物逻辑门 pH-响应镍离子响应 ATP-响应

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