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DNA合成错误纠正及相关检测新技术研究

DNA合成错误纠正及相关检测新技术研究

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作者：沈皖珠安徽医科大学

学位级别：硕士

DNA从头合成技术是以化学合成寡核苷酸链为起始制备长片段DNA技术。凭借设计灵活、不受天然模板限制、可规模化生产等显著优势,DNA从头合成迅速发展成为合成生物学的底层支撑技术。目前基因片段的人工合成及组装中存在的一个重大问题是... 详细信息

DNA从头合成技术是以化学合成寡核苷酸链为起始制备长片段DNA技术。凭借设计灵活、不受天然模板限制、可规模化生产等显著优势,DNA从头合成迅速发展成为合成生物学的底层支撑技术。目前基因片段的人工合成及组装中存在的一个重大问题是DNA产物保真度较差,在寡核苷酸的化学合成、短片段组装及拼接过程中都会引入碱基错误,导致获得正确产物的筛选难度增大、测序成本增加,严重影响合成效率。基于错配切割法和错配结合法的DNA合成错误纠正技术可有效降低合成序列的错误率,减少重复克隆筛选工作量、时间和成本。但现有DNA合成错误纠正技术因试剂昂贵、单种纠错酶纠错效果不稳定、操作复杂等问题,并没有大规模应用于DNA合成中。在本研究中,我们提出了一种基于多种错配切割酶协同作用的组合酶纠错体系,利用多种酶之间不同的作用机制来开发纠错效果稳定、适合不同目标序列且成本较低的酶法纠错新技术。同时,对基于错配结合酶Mut S蛋白的物理分离纠错法进行了验证,利用Mut S蛋白固定化的FeO颗粒作为错配双链捕获工具,简化纠错后DNA溶液回收操作,使DNA合成错误纠正法可以向着自动化方向发展。最后,基于磁性纳米标签材料开发了新型的表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)免疫层析检测新技术,用于DNA错配序列及肿瘤标志物的高灵敏检测。论文的主要研究内容如下:(1)一种新型的组合酶纠错体系的开发及优化筛选十种常用错配切割酶,比较各酶纠错特性如正确克隆提高比例、错误率降低幅度,选择纠错效果最佳的错配切割酶组合。试验不同组合酶(种类、数量等)纠正1.2千碱基对(kb)和3.7kb序列效果。优化组合酶纠错反应条件,包括反应时间、反应温度、反应缓冲液、酶用量、纠错次数。对组合酶纠正2.1kb和2.5kb序列进行性能验证。经过筛选和优化,建立了组合酶错配切割纠错法,合成的DNA序列正确率比T7核酸内切酶I纠错后正确率提高1～2倍,二轮纠错效率与商业化纠错试剂Surveyor相当,对部分序列纠错效果甚至超过Surveyor。(2)基于Mut S蛋白固定化磁珠的纠错能力评价采用碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)化学偶联法将三种Mut S蛋白分别修饰在羧基化磁珠上,试验磁珠@Mut S特异性结合固定错配双链和非特异性结合同源双链能力,并筛选出纠错活性最强的Taq Mut S蛋白。设计两种磁珠@Mut S纠错策略,一是试验磁珠@Mut S单独纠正1.2kb序列效果,二是试验核酸内切酶V与磁珠@Mut S联合纠正1.2kb序列效果。实验结果表明核酸内切酶V与磁珠@Mut S联合纠正1.2kb DNA序列可将错误率从2.35/kb降至1.64/kb。磁珠@Mut S与核酸内切酶V联合纠错法可有效降低序列错误率,为DNA人工合成中的错误纠正提供了新的研究方法与思路。(3)发明一种磁性SERS层析法用于DNA错配序列及肿瘤标志物的检测首先采用具有SERS活性及磁富集能力的金壳磁性纳米材料(FeO@Au)作为检测标签,在其表面修饰Taq Mut S蛋白用于溶液中DNA错配序列的捕获。通过在免疫层析试纸条上构建检测线(T线)的方式,捕获形成的FeO@Au-Mut S-DNA错配序列,并通过检测T线产生的SERS信号实现对错配序列的快速检测。此外,为了进一步提升磁性SERS层析的灵敏度,发明了一种树莓状的FeO@Au作为新型SERS标签,具有精密的表面缝隙和极强的SERS性能。最后利用基于树莓状FeO@Au标签构建用于肿瘤标志物联合检测的磁性SERS免疫层析体系,实现了三种常见肿瘤标志物的高灵敏定量检测。

关键词： DNA从头合成错配切割组合酶 MutS蛋白表面增强拉曼光谱纸层析

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