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沙雷氏菌S2中铬还原酶的分离纯化与鉴定

基因组学与应用生物学 2019年第10期38卷 4545-4551页

作者：顾芮嘉董兰岚何元白群华贾燕肖虹重庆医科大学公共卫生与管理学院

探讨沙雷氏菌S2中铬还原酶的分离纯化与鉴定的系统方法,利用从铬污染环境中筛选出的除铬菌沙雷氏菌S2,以超声破碎的方法提取细菌总蛋白,分别采用硫酸铵分级沉淀,Q-Sepharose H.P.琼脂糖凝胶阴离子交换层析和SephadexG-100凝胶过滤层析... 详细信息

探讨沙雷氏菌S2中铬还原酶的分离纯化与鉴定的系统方法,利用从铬污染环境中筛选出的除铬菌沙雷氏菌S2,以超声破碎的方法提取细菌总蛋白,分别采用硫酸铵分级沉淀,Q-Sepharose H.P.琼脂糖凝胶阴离子交换层析和SephadexG-100凝胶过滤层析分离纯化铬还原酶。通过纯化,酶比活力显著提高到15.41 U/mg,且酶比活力的纯化倍数高达940倍。用葡聚糖凝胶过滤法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对其进行分子量判断和纯度鉴定,随后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)鉴定该酶的蛋白质性质。分离纯化后得到的铬还原酶分子量为47 kD,编码431个氨基酸,与该酶肽质量指纹图谱符合率最高(30%)的已知蛋白质是NADH醌氧化还原酶亚基D(NuoD),说明从沙雷氏菌S2中得到的铬还原酶属于NuoD。本研究为沙雷氏菌S2中铬还原酶的后续酶学研究及功能基因研究提供了良好的基础。

关键词：沙雷氏菌铬还原酶分离纯化鉴定

沙雷氏菌S2基因组序列分析及铬还原酶ChrT基因工程菌除Cr(Ⅵ)特性研究

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沙雷氏菌S2基因组序列分析及铬还原酶ChrT基因工程菌除Cr(Ⅵ)特性...

作者：邓鹏重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:对沙雷氏菌S2进行全基因组测序,分析其除铬相关基因,为除Cr(Ⅵ)工程菌的构建奠定生物学信息基础;研究铬还原酶ChrT基因工程菌的除Cr(Ⅵ)能力及影响因素,分析铬还原酶ChrT的除Cr(Ⅵ)活性,同时探究ChrT工程菌的生物学特性稳定性,综... 详细信息

目的:对沙雷氏菌S2进行全基因组测序,分析其除铬相关基因,为除Cr(Ⅵ)工程菌的构建奠定生物学信息基础;研究铬还原酶ChrT基因工程菌的除Cr(Ⅵ)能力及影响因素,分析铬还原酶ChrT的除Cr(Ⅵ)活性,同时探究ChrT工程菌的生物学特性稳定性,综合验证工程菌的除Cr(Ⅵ)特性。方法:提取沙雷氏菌S2的DNA,进行基因组测序,分析基因组中的除铬相关基因,从分子水平探讨其除Cr(Ⅵ)机制。比较ChrT工程菌与沙雷氏菌S2、宿主菌E.coli BL21(DE3)的除Cr(Ⅵ)能力,并探索培养条件(pH、温度、碳源和金属离子)对其除Cr(Ⅵ)效率的影响;铬还原酶ChrT经IPTG诱导表达后,用酶促反应鉴定其活性。然后将工程菌连续传50代,每10代进行菌落形态、革兰氏染色、生化反应、质粒稳定性、目的蛋白表达水平和铬还原能力等各项检测,以评价工程菌的遗传稳定性。结果:基因测序得到了沙雷氏菌S2的基因组序列精细图谱,确定其基因组大小为5,604,115 bp;经基因库比对,基因组中含有与铬耐受和铬还原有关的基因12个。工程菌在50 mg/L Cr(Ⅵ)培养基中,48 h后,除Cr(Ⅵ)率可达40%。37℃、pH为7.0是工程菌的最佳培养条件;乳酸钠、乙酸钠、Cu2+、Co2+和Pb2+对其除Cr(Ⅵ)能力具有促进作用。IPTG诱导产生的铬还原酶ChrT,在NADPH为供电体条件下,酶活性可达14.83 U/mg。经传代培养后,各代工程菌的质粒均含铬还原酶ChrT的目的基因片段,革兰染色、生化检测、目的蛋白表达水平均与原始菌株无差异,除Cr(Ⅵ)能力也与原始菌株无统计学差异性(p>0.05)。结论:沙雷氏菌S2基因组中含有除Cr(Ⅵ)相关的基因,可应用于高效除Cr(Ⅵ)基因工程菌的构建。ChrT工程菌及其诱导产生的铬还原酶具有一定的Cr(Ⅵ)还原能力,且该菌种生物学特性稳定,具有修复土壤或水体铬污染的潜力。

关键词：沙雷氏菌铬还原酶工程菌生物学特性稳定性

沙雷氏菌CQMUS2铬还原酶ChrT基因的克隆、表达及酶活性的初步研究

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沙雷氏菌CQMUS2铬还原酶ChrT基因的克隆、表达及酶活性的初步研究

作者：谭小庆重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：从沙雷氏菌（Serratia sp.） CQMUS2中克隆铬还原酶T(Chromate reductase T, ChrT)的全基因序列，构建其原核表达载体pET-28a(+)-ChrT并转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，通过诱导表达和亲和层析纯化，初步研究ChrT的酶活性及其... 详细信息

目的：从沙雷氏菌（Serratia sp.） CQMUS2中克隆铬还原酶T(Chromate reductase T, ChrT)的全基因序列，构建其原核表达载体pET-28a(+)-ChrT并转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，通过诱导表达和亲和层析纯化，初步研究ChrT的酶活性及其对Cr(VI)的还原能力。方法：采用RCR和高效热不对称交错PCR (High-efficiencythermal asymmetric interlaced PCR, hiTAIL-PCR)技术从Serratia sp.CQMUS2菌株中扩增ChrT全基因序列，测序并利用生物信息学软件分析其序列特征。将获得的ChrT基因与克隆载体pMD19-T及表达载体pET-28a(+)进行连接，并转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)，得到基因工程菌。利用IPTG诱导表达工程菌，观察ChrT在不同时间的表达水平;提取工程菌外周质、可溶物及包涵体成分经SDS-PAGE电泳观察重组蛋白的表达形式及定位分析;采用Ni-NTA柱纯化目的蛋白ChrT，利用辅酶NADPH在340nm处的吸光度值变化检测重组ChrT酶活性，同时根据反应体系中Cr(VI)变化情况评价ChrT酶对Cr(VI)的还原能力。结果：从Serratia sp. CQMUS2菌株中克隆得到铬还原酶ChrT全基因序列，该基因序列长为567bp，编码188aa;多重序列比对及进化分析表明，其76%属于高度保守且与肺炎克雷伯菌亲缘关系最近;3D结构特征与已知的大肠杆菌铬还原酶ChrR相似度为85.6%。以该基因构建的基因工程菌pET-28a(+)-ChrT/BL21经IPTG诱导，表达产物随时间递增逐渐增加，10h后达最高;表达产物定位及可溶性分析发现该重组酶主要以可溶性成分存在于细胞质中;经Ni-NTA柱纯化的ChrT酶能利用辅酶NADPH，使得NADPH的A340在5min内迅速下降94.5%;ChrT酶能还原酶促反应体系中的Cr(VI)，使实验组Cr(VI)含量显著低于对照组（P＝0.000），酶活性为164U/mg。结论：成功构建的基因工程菌pET-28a(+)-ChrT/BL21能够正确表达重组蛋白ChrT，且该酶具有Cr(VI)还原活性，为进一步研究高效除铬工程菌提供了菌种资源和基因资源。

关键词：沙雷氏菌铬还原酶表达六价铬还原

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铬还原酶ChrT工程菌的遗传稳定性研究

现代医药卫生 2016年第18期32卷 2789-2792页

作者：周思敏唐娴邓鹏董兰岚何元贾燕白群华肖虹重庆医科大学公共卫生与管理学院/医学与社会发展研究中心/健康领域社会风险预测治理协同创新中心重庆400016

目的研究重组铬还原酶ChrT工程菌的遗传稳定性。方法将ChrT工程菌传至50代,每10代进行遗传稳定性相关检测。同时设置不加菌液的对照组作为空白对照组。结果各代ChrT工程菌的菌落生长形态、革兰染色、生化反应结果与原代菌株一致;各代Chr... 详细信息

目的研究重组铬还原酶ChrT工程菌的遗传稳定性。方法将ChrT工程菌传至50代,每10代进行遗传稳定性相关检测。同时设置不加菌液的对照组作为空白对照组。结果各代ChrT工程菌的菌落生长形态、革兰染色、生化反应结果与原代菌株一致;各代ChrT工程菌质粒稳定,ChrT基因序列未见突变或丢失;经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,各代ChrT工程菌的目的蛋白表达水平与原代无明显差别;在含六价铬[Cr(Ⅵ)]50 mg/L的LB液体培养基中,与空白对照组比较,48 h后各代ChrT工程菌培养基中Cr(Ⅵ)的质量浓度明显减少,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 ChrT工程菌生物学特性稳定,可用于治理环境中Cr(Ⅵ)的污染。

关键词：铬大肠杆菌基因表达生物转化铬还原酶工程菌遗传稳定性

一株芽孢杆菌Bacillus sp.CRB-1六价铬还原特性及还原机制的研究

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一株芽孢杆菌Bacillus sp.CRB-1六价铬还原特性及还原机制的研究

作者：朱云飞华南理工大学

学位级别：硕士

六价铬是一种高毒性的污染物,严重威胁人类健康和生态环境平衡。利用微生物将六价铬还原为低毒性的三价铬是环境铬污染治理的重要途径,微生物六价铬还原作用的研究也一直是相关领域的研究热点。但是目前大部分的研究集中在六价铬还原条... 详细信息

六价铬是一种高毒性的污染物,严重威胁人类健康和生态环境平衡。利用微生物将六价铬还原为低毒性的三价铬是环境铬污染治理的重要途径,微生物六价铬还原作用的研究也一直是相关领域的研究热点。但是目前大部分的研究集中在六价铬还原条件的优化或者还原酶的定位,而未能进一步地鉴定六价铬还原酶,因此微生物的六价铬还原分子机制尚不透彻,无法精确有效的为微生物用于环境铬污染治理提供科学依据。本研究以Cr(Ⅵ)还原菌Bacillus sp.CRB-1为研究对象,通过单因素条件优化,研究了不同环境因子和培养方式对芽孢杆菌CRB-1还原Cr(Ⅵ)的影响。通过检测静息细胞,渗透细胞和亚细胞组分的Cr(Ⅵ)还原能力,并利用傅里叶红外光谱技术检测Cr(Ⅵ)还原产物的存在形式,从而初步揭示了芽孢杆菌CRB-1的Cr(Ⅵ)还原机制。通过相对荧光定量PCR,基因的异源表达及体外酶活测定,鉴定了芽孢杆菌CRB-1与Cr(Ⅵ)还原和耐受有关的基因。最终通过结合Cr(Ⅵ)还原特性和还原机制的研究,以期为微生物治理环境铬污染提供理论依据。本文的主要研究结果如下:(1)筛选到了一株具有Cr(Ⅵ)还原能力的芽孢杆菌CRB-1,其最高Cr(Ⅵ)耐受浓度为300mg/L,并且可在24 h将50 mg/L Cr(Ⅵ)完全还原。(2)优化了芽孢杆菌CRB-1的还原条件。芽孢杆菌CRB-1在p H 8.0,42℃,盐浓度1%,接种量10 cells/m L,以及好氧震荡条件下呈现出最佳的Cr(Ⅵ)还原效率。(3)明确了芽孢杆菌CRB-1的Cr(Ⅵ)还原位点。芽孢杆菌CRB-1的Cr(Ⅵ)还原过程发生在胞内,由细胞质中的NADPH依赖型还原酶介导;分析了Cr(Ⅵ)还原产物的分布位置,还原产物Cr(Ⅲ)与胞外多聚物结合形成了复合物,以可溶性形式分布于培养上清中。(4)荧光定量PCR结果显示nit R2基因和chr A基因的转录水平受Cr(Ⅵ)胁迫而上调;体外酶活测定证实了Nit R2具有Cr(Ⅵ)还原活性,是NADPH依赖型的铬还原酶,而Chr A作为铬酸盐转运蛋白,则是通过将胞内过剩的Cr(Ⅵ)转运至胞外,从而提高芽孢杆菌CRB-1对Cr(Ⅵ)的耐受性。

关键词：芽孢杆菌六价铬铬还原铬还原酶还原终产物

制革工业含铬污泥耐铬菌株的分离及对污泥处置研究

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制革工业含铬污泥耐铬菌株的分离及对污泥处置研究

作者：王瑜谦河南师范大学

学位级别：硕士

制革污泥中由于含有多种有机物、重金属(特别是铬)、硫化物、盐、蛋白质、多酚类化合物、表面活性剂、染料和合成鞣剂制等有毒有害的化学物质,使其成为了一种极难处理的固体废弃物。目前的研究主要是针对含铬制革污泥中铬的去除,有关含... 详细信息

制革污泥中由于含有多种有机物、重金属(特别是铬)、硫化物、盐、蛋白质、多酚类化合物、表面活性剂、染料和合成鞣剂制等有毒有害的化学物质,使其成为了一种极难处理的固体废弃物。目前的研究主要是针对含铬制革污泥中铬的去除,有关含铬制革污泥减量化处理的研究很少,传统的物化处理方法存在费用高、容易产生二次污染等问题,因此,更需要找到一种经济有效的方法处理该类固体废弃物。本研究通过对高铬污泥中的微生物进行分离驯化和富集培养,得到18株耐铬菌株,通过添加这些耐铬菌株对含高铬污泥进行减量化处理。同时还研究耐铬菌株的特性(Cr(VI)的耐受性、还原性、温度、pH等)以及耐铬机理。主要的研究内容如下:1.耐铬菌株对含铬制革污泥减量化处理的研究。从含高铬制革污泥中分离筛选出的耐铬菌株,通过富集培养后投加到制革污泥中进行减量化处理,结果表明,从含高铬污泥中分离出的18株耐铬菌株,可有效地减少污泥的量,在加入混合耐铬菌株后的前15天内,污泥的量不断减少且污泥的减量符合一级反应动力学,当接菌量为2%和20%时,污泥分别减少了6%和26%,随着制革污泥量的减少,TOC也在不断减少,当接种量为20%时,TOC的最大去除率可达30%。温度、pH、碳源对污泥的减量也有一定的影响。2.耐铬优势菌株的性能研究。通过对筛选出的耐铬菌株的耐受性和还原性实验的研究,结果表明,从含高铬污泥中分离出的18株耐铬菌株中有5株表现出较强的耐受性和还原性,分别为Stenotrophomonas pavanii WY601、Bacillus cereus BPC543、Bacillus subtilis strain BTS741、Microbacterium sp.MMCC609、Proteus mirabilis PCL312。当Cr(Ⅵ)浓度为300 mg/L时,WY601、MMCC609、BPC543、BTS741、PCL312菌株对Cr(Ⅵ)的去除率分别为90%、79%、83.8%、84.12%、90.12%。在最佳条件下(37℃,180rpm,pH 6),WY601、BPC543、BTS741、MMCC609、PCL312菌株在70 h内,对Cr(Ⅵ)(600 mg/L)还原性都可达80%以上,而这五株优势混合菌在40 h内,对Cr(Ⅵ)(600 mg/L)还原率可达100%。WY601、BPC543、BTS741、MMCC609、PCL312菌株对其它重金属Pb、Fe、Mn、Zn、Ni、Cd、Cu、Co也具有较强的去除能力。3.WY601菌株耐铬机理的研究。通过对WY601菌株还原酶实验的研究,结果表明,WY601菌株对铬的还原作用主要发生在胞外和细胞膜上,胞外分泌物在铬的解毒过程中起主要作用;当pH为7,温度为37℃时,该还原酶的活性和相对稳定性最高;不同的重金属离子和电子供体对WY601菌株的还原酶活性明显具有不同的影响,在所考察的金属离子中,Cu对铬还原酶的活性明显提高了20%,而Hg对酶具有较强的抑制性,使其相对活性减少到35%。在考察的所有电子供体中,都可以提高还原酶活性。

关键词：制革污泥耐铬菌株铬还原酶污泥减量化

细菌Pannonibacter sp.还原Cr（Ⅵ）的特性及其基因表征研究

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细菌Pannonibacter sp.还原Cr（Ⅵ）的特性及其基因表征研究

作者：曾娟中南大学

学位级别：硕士

铬被广泛用于皮革制造、电解电镀和染料制造等行业,创造了巨大的经济效益,同时给环境带来严重污染。其中六价铬能致畸、致癌和致突变,是国际公认的八大危险废物之一,因此铬污染的治理一直是环保领域的重大课题。传统的物理化学方法,处... 详细信息

铬被广泛用于皮革制造、电解电镀和染料制造等行业,创造了巨大的经济效益,同时给环境带来严重污染。其中六价铬能致畸、致癌和致突变,是国际公认的八大危险废物之一,因此铬污染的治理一直是环保领域的重大课题。传统的物理化学方法,处理成本昂贵且产生二次污染,因此,生物法治理铬污染具有非常广阔的应用前景。本研究从铬污染土壤中分离得到一株高效铬还原菌。经形态和生理生化特征分析及16s rDNA序列比对,鉴定为Pannonibacter sp.。通过对该细菌还原铬性能及分子生化研究,为利用该细菌治理铬污染提供实际指导,同时为制造高效还原的工程菌及建立该菌的基因文库奠定基础。对细菌Pannonibacter sp.的静息细胞的六价铬还原特性进行详细深入研究,研究结果表明,含铬培养基培养和不含铬培养基培养的体系中,得到的Pannonibacter sp.菌静息细胞均能高效还原六价铬,且还原速率基本相同;Pannonibacter sp.的生长需要氧气,但氧气抑制其静息细胞的还原能力。还原过程无营养源存在时,厌氧条件下反应速率最快,兼性条件次之,富氧条件下Pannonibacter sp.菌几乎不能还原六价铬;外加营养源能改变Pannonibacter sp.菌静息细胞还原Cr（Ⅵ）的速率,在厌氧条件下,乳酸钠与葡萄糖对还原的促进作用基本相同,而在富氧条件下,葡萄糖对还原的促进作用很小;Pannonibacter sp.菌静息细胞通过团聚,相互协作还原Cr（Ⅵ）。对该菌株六价铬还原酶的性质及还原机制进行了初步的研究,研究结果表明,细菌的细胞壁膜能阻止六价铬进入细胞,是六价铬发生还原的主要场所,其通透性的改变将影响六价铬还原酶的作用,该菌株六价铬还原酶为非分泌型,在细菌细胞内侧发生作用。提取基因组DNA发现基因组DNA只有一条带,且对Pannonibacter sp.菌和E.coli.同时提取质粒,检测不到DNA分子,结合Kan抗生素抗性基因克隆,表明Pannonibacter sp.菌没有质粒,Pannonibacter sp.菌六价铬还原基因位于基因组DNA上。

关键词： Pannonibacter sp. 六价铬还原静息细胞铬还原酶微生物鉴定还原机制