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疫苗中铝佐剂含量高效液相色谱检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2024年第1期37卷 58-64页

作者：邵天舒李潇李玉立赵璇梅婕何欢李文东北京市药品检验研究院国家药品监督管理局创新药物安全研究与评价重点实验室北京102206

目的建立疫苗中铝佐剂含量的高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定方法,并进行验证及初步应用。方法采用8-羟基喹啉衍生化方法进行测定。色谱柱为苯基-己基色谱柱[Luna 5u Phenyl-Hexyl(250 mm×4.6 mm)],... 详细信息

目的建立疫苗中铝佐剂含量的高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定方法,并进行验证及初步应用。方法采用8-羟基喹啉衍生化方法进行测定。色谱柱为苯基-己基色谱柱[Luna 5u Phenyl-Hexyl(250 mm×4.6 mm)],流动相为乙酸铵-8-羟基喹啉乙腈溶液(60∶40),并添加终浓度为20 mg/L的抗坏血酸,荧光检测器激发波长380 nm,发射波长520 nm,流动相流速为1.0 mL/min,柱温为40℃,进样量为50μL,等度洗脱。对方法的专属性、线性范围、准确性、重复性、稳定性和耐用性进行验证。采用建立的方法测定12批疫苗中的铝含量,并与《中国药典》三部(2020版)通则3106的滴定法测定结果进行比较。结果样品色谱图中无干扰色谱峰,非铝佐剂疫苗成分、磷酸盐缓冲液对测定均无干扰。铝标准品在6.25~100μg/mL浓度范围内线性关系良好,r=0.999 6;准确性验证试验中甲型肝炎灭活疫苗、重组乙型肝炎疫苗、吸附无细胞百白破疫苗及肠道病毒71型灭活疫苗铝含量平均加样回收率分别为98.32%、100.85%、101.09%和99.31%;4种疫苗同批次平行6份供试品溶液中铝含量检测结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为1.09%、1.42%、0.97%和1.30%;4种疫苗样品溶液室温放置0、2、4、6、8 h,铝含量检测结果的RSD分别为0.82%、0.73%、0.40%和0.48%;流动相中乙酸铵溶液与8-羟基喹啉乙腈溶液比例在±5%范围改变时,4种疫苗铝含量测定结果波动范围均不超过2%。建立的HPLC法测定12批疫苗样品中铝含量结果与《中国药典》三部(2020版)滴定法结果无明显差异。结论成功建立了疫苗中铝佐剂含量HPLC测定方法,该方法专属性、线性、准确性、重复性、稳定性、耐用性良好,操作简便且自动化程度高,人为因素干扰少,可实现单支样品测定,为快速大批量测定疫苗成品中铝含量,以及生产过程中监控半成品分装提供了有效手段。

关键词：疫苗铝佐剂高效液相色谱

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新型含铝疫苗佐剂的研究进展

中国药科大学学报 2024年

作者：任红梅熊晔蓉荀校莹姜雷涂家生中国药科大学药学院药用辅料及仿创药物研发评价中心

铝佐剂因其诱导高效持久的免疫应答作用和良好的安全性在疫苗领域被广泛应用。随着免疫学的发展，对于佐剂的要求逐渐提高，传统铝佐剂已无法满足某些应用需求。因此，为实现良好的免疫增强效果及诱导特定类型和强度的免疫反应，新型铝... 详细信息

铝佐剂因其诱导高效持久的免疫应答作用和良好的安全性在疫苗领域被广泛应用。随着免疫学的发展，对于佐剂的要求逐渐提高，传统铝佐剂已无法满足某些应用需求。因此，为实现良好的免疫增强效果及诱导特定类型和强度的免疫反应，新型铝佐剂的开发已成为研究热点。本综述介绍了铝佐剂的作用机制及安全性，并重点概述了近年来新型铝佐剂的研究进展，主要包括纳米铝佐剂和复合铝佐剂（铝佐剂与免疫刺激分子或递送载体复合），并对其未来的研究方向进行了展望，以期为铝佐剂的进一步开发和临床应用提供参考。

关键词：疫苗铝佐剂纳米铝佐剂复合铝佐剂免疫反应

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铝佐剂颗粒化乳液制备及其免疫效果研究

过程工程学报 2022年第2期22卷 195-203页

作者：彭沙夏宇飞高晓冬江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室北京100190

铝佐剂是我国唯一临床批准使用的疫苗佐剂,但其自身难以引发有效的细胞免疫应答,无法对机体产生综合性的保护,难以满足日益增长的疫苗佐剂需求。因此,如何合理化改造铝佐剂,保证疫苗佐剂的安全及高效诱导免疫反应是亟待解决的问题。本... 详细信息

铝佐剂是我国唯一临床批准使用的疫苗佐剂,但其自身难以引发有效的细胞免疫应答,无法对机体产生综合性的保护,难以满足日益增长的疫苗佐剂需求。因此,如何合理化改造铝佐剂,保证疫苗佐剂的安全及高效诱导免疫反应是亟待解决的问题。本工作通过对商品化铝佐剂制备乳液超声条件的优化,最终研究表明当颗粒浓度为2.0 mg/mL,水相缓冲液选择蒸馏水且pH为7.0时能制备得到稳定的颗粒化乳液(Alum Particulate Emulsion,APE),制备得到的乳液平均粒径为2723.7±435.3 nm,Zeta电位为+40.5±1.5 m V。离心发现此时体系中没有游离的铝佐剂,表明2.0 mg/mL是能稳定乳液的最小颗粒浓度。将乳液与抗原共混,测量抗原的吸附率,结果显示,抗原的吸附率接近100%,共聚焦的结果也验证了乳液对抗原的高吸附特性。当乳液与DC(Dendritic Cells)细胞共孵育,可以观察到乳液的内吞及溶酶体逃逸,而传统的铝佐剂无法实现。ELISpot结果显示,APE组脾细胞中分泌IFN-γ的T细胞数量比铝佐剂组增加300%左右。将铝佐剂通过颗粒化的策略制备得到APE以后,改变了佐剂增强抗原的免疫效果,显著提升了传统铝佐剂的细胞免疫效果。

关键词：疫苗 Pickering乳液铝佐剂细胞免疫溶酶体逃逸

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影响含铝佐剂疫苗吸附率和解离率的因素分析

中国医药工业杂志 2023年第5期54卷 719-725页

作者：刘超张艳艳北京博康健基因科技有限公司北京102200 印度瑞迪博士实验室有限公司北京代表处北京100022

吸附率和解离率作为含铝佐剂疫苗重要的体外质量评价指标,是降低临床试验风险的重要保证。随着含铝佐剂疫苗评价手段的不断升级和工艺研究的日益深化,行业也对可为相关产品提供系统解析和深入分析的参考资料提出了更高层次的需求。该文... 详细信息

吸附率和解离率作为含铝佐剂疫苗重要的体外质量评价指标,是降低临床试验风险的重要保证。随着含铝佐剂疫苗评价手段的不断升级和工艺研究的日益深化,行业也对可为相关产品提供系统解析和深入分析的参考资料提出了更高层次的需求。该文基于项目实践经验,重点从佐剂特性、抗原特点和工艺特征方面论述分析,辅以评价方法设计的改善建议,系统总结了原辅料、铝佐剂、制剂工艺、检测方法等影响含铝佐剂疫苗吸附率和解离率的因素,旨在为制剂产品的开发提供参考和借鉴。

关键词：铝佐剂疫苗吸附率解离率

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铝佐剂含量检测方法的探讨

中国生物制品学杂志 2022年第6期35卷 752-758页

作者：王平(综述) 刘梅影(审校) 国药中生生物技术研究院有限公司北京101111

从铝佐剂使用原则出发,结合新出台法规对铝佐剂和含铝佐剂疫苗精准质量控制的要求,对目前铝佐剂含量常用检测方法——络合滴定法进行探讨。围绕铝佐剂含量检测灵敏度,在了解国内外各行业铝含量检测研究现状的基础上,将具有代表性的方法... 详细信息

从铝佐剂使用原则出发,结合新出台法规对铝佐剂和含铝佐剂疫苗精准质量控制的要求,对目前铝佐剂含量常用检测方法——络合滴定法进行探讨。围绕铝佐剂含量检测灵敏度,在了解国内外各行业铝含量检测研究现状的基础上,将具有代表性的方法进行整理和归纳。系统介绍了分光光度法、色谱法、原子吸收光谱法(atomic absorption spectrophotometry,AAS)和电感耦合等离子体法(inductive coupled plasma emission spectrometry,ICP)等检测方法原理、过程以及应用局限性,并对检测方法的样品前处理条件进行介绍,为根据检测要求和实验条件对疫苗类产品铝含量检测方法的选取提供参考。

关键词：铝佐剂含量原子吸收光谱法电感耦合等离子体法

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铝佐剂的潜在抗银屑病皮肤炎症药理功能研究

铝佐剂的潜在抗银屑病皮肤炎症药理功能研究

作者：廖燕杭厦门大学

学位级别：硕士

银屑病,是皮肤病中发病率较广泛的一种的慢性炎症性疾病,主要归因于角质形成细胞异常增殖分化、真皮中的免疫细胞浸润以及血管异常增生。虽然许多生物疗法已被证明是临床上有效缓解银屑病的皮肤炎症,更安全的治疗方法仍需要发展,因为疾... 详细信息

银屑病,是皮肤病中发病率较广泛的一种的慢性炎症性疾病,主要归因于角质形成细胞异常增殖分化、真皮中的免疫细胞浸润以及血管异常增生。虽然许多生物疗法已被证明是临床上有效缓解银屑病的皮肤炎症,更安全的治疗方法仍需要发展,因为疾病药物停药后复发率高和限制患者的感染与生物相关的风险。本课题中旨在探究铝佐剂能否调控皮肤中TH2型细胞炎症反应从而恢复在银屑病发生发展过程中TH1/TH17和TH2型免疫反应的失衡。探究铝佐剂的潜在治疗作用从而减轻甚至治疗银屑病,有望为开发创新型皮肤炎症治疗药物提供新思路和理论基础。实验采用用咪喹莫特(IMQ)乳膏局部涂于C57BL/6小鼠背部剃光的皮肤上,诱导银屑病样皮肤病变。咪喹莫特处理的动物随机接受铝佐剂腹腔注射或其对照(0.9%生理盐水腹腔注射),并收集皮肤活检和皮肤引流淋巴结进行苏木精/伊红染色、组织免疫荧光染色、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)和流式细胞术分析。用流式细胞仪(FACS)检测铝佐剂对小鼠脾原代细胞的体外作用。咪喹莫特处理后动物皮肤出现红斑、鳞片、表皮增厚。组织染色结果显示,铝佐剂能有效减少表皮厚度,减少表皮棘层厚度,减少真皮炎性细胞浸润。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,铝佐剂降低咪喹莫特介导的S100A8、KRT6、白介素IL-17A和IL-1β的表达,增加Th2相关基因的表达。FACS分析显示铝佐剂抑制了na(?)ve T细胞向Th1细胞的体外分化。我们的研究结果表明,铝佐剂可有效缓解小鼠银屑病样皮肤炎症,可能通过恢复TH1/TH17和TH2型免疫应答的平衡,为银屑病的治疗提供一种新的途径。

关键词：银屑病铝佐剂咪喹莫特 T辅助细胞

不同解离液及解离条件下新型冠状病毒灭活疫苗中铝佐剂的解离效果

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中国生物制品学杂志 2022年第11期35卷 1287-1292页

作者：施金荣申瑷琳邓涛潘俊杰刘青程小玲罗敏段凯武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430207 国家联合疫苗工程技术研究中心湖北武汉430207

目的探讨不同解离液及解离条件下新型冠状病毒灭活疫苗中铝佐剂的解离效果。方法配制6种解离液(1~6),将新型冠状病毒灭活疫苗成品分别与6种解离液混合,于37℃解离20 h,ELISA法检测抗原含量,解离度最高的为最佳解离液。将新型冠状病毒灭... 详细信息

目的探讨不同解离液及解离条件下新型冠状病毒灭活疫苗中铝佐剂的解离效果。方法配制6种解离液(1~6),将新型冠状病毒灭活疫苗成品分别与6种解离液混合,于37℃解离20 h,ELISA法检测抗原含量,解离度最高的为最佳解离液。将新型冠状病毒灭活疫苗成品与最佳解离液混合,于室温或37℃分别解离2、10和20 h,ELISA法检测A450,以A450最高的解离条件为最佳。对最佳解离液及解离条件进行干扰试验及准确性、精密性、耐用性、适用性验证。结果最佳解离液为解离液5[0.1%(v/v)TritonX-100,0.1 mol/L EDTA,0.05%(v/v)Tween20],最佳解离条件为:37℃解离20 h。添加与未加解离液5的新型冠状病毒灭活疫苗原液检测结果差异无统计学意义(t=0.963,P>0.05);重复检测6次新型冠状病毒灭活疫苗参考品的抗原含量回收率在98.13%~100.63%之间;同一实验员于不同时间及不同实验员于同一时间重复检测6次结果的CV均<10%;解离16、20、24 h检测结果的CV均<10%,ELISA检测过程中终止反应后放置0、10、20 min检测结果的CV均<1%;4批新型冠状病毒灭活疫苗成品检测结果的CV均<10%。结论本研究确定的最佳解离液和解离条件效果较好,解离液干扰小,且准确性、精密性、耐用性和适用性良好,为新型冠状病毒灭活疫苗的质量控制提供了可靠的检测方法。

关键词：解离液解离条件新型冠状病毒灭活疫苗铝佐剂

铝佐剂被巨噬细胞吞噬后的线粒体事件:进展与思考

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生物化学与生物物理进展 2021年第5期48卷 560-569页

作者：黄丽婷梁桂兆吕凤林重庆大学生物工程学院重庆400030 生物流变科学与技术教育部重点实验室重庆400030

氢氧化铝作为疫苗佐剂被广泛运用的重要原因是能够被抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APC)如树突状细胞(dendritic cells,DC)、巨噬细胞(macrophages,M?)识别、吞噬,并增强其提呈抗原的能力,实现有效免疫应答.APC吞噬受铝佐剂辅... 详细信息

氢氧化铝作为疫苗佐剂被广泛运用的重要原因是能够被抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APC)如树突状细胞(dendritic cells,DC)、巨噬细胞(macrophages,M?)识别、吞噬,并增强其提呈抗原的能力,实现有效免疫应答.APC吞噬受铝佐剂辅佐的抗原后将激活溶酶体、线粒体等细胞器,其中线粒体表现尤为明显:如线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,m ROS)、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)及线粒体糖脂代谢等会发生一系列变化.我们也发现了巨噬细胞可以快速吞噬铝佐剂辅佐的抗原,并快速激活机体免疫应答.那么,发生"快吞噬、快激活"的物质基础应该需要更多的能量支撑,为此我们推测线粒体的生物学行为会更加活跃,在实现免疫应答后也许对M?造成"大伤害".本文将对该现象做一综述并引出关于下一步需要解决的问题的思考.

关键词：铝佐剂巨噬细胞线粒体 ATP 纳米颗粒

纳米硒乳酸菌优化制备及其作为铝佐剂疫苗免疫增强剂的研究

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纳米硒乳酸菌优化制备及其作为铝佐剂疫苗免疫增强剂的研究

作者：孙伟姣东北农业大学

学位级别：硕士

纳米硒乳酸菌已被证实具有抗氧化、抗衰老以及抗癌等益生功能。但是关于纳米硒乳酸菌是否可以提升疫苗免疫效果,目前未见详细报道。因此,本研究优化制备纳米硒乳酸菌,探究不同形式的纳米硒乳酸菌作为疫苗免疫增强剂的潜力,并进一步解析... 详细信息

纳米硒乳酸菌已被证实具有抗氧化、抗衰老以及抗癌等益生功能。但是关于纳米硒乳酸菌是否可以提升疫苗免疫效果,目前未见详细报道。因此,本研究优化制备纳米硒乳酸菌,探究不同形式的纳米硒乳酸菌作为疫苗免疫增强剂的潜力,并进一步解析相关机制,为纳米硒乳酸菌作为疫苗免疫增强剂提供理论依据。针对目前用益生乳酸菌转化生成纳米硒效率较低的问题,本研究首先优化条件制备纳米硒乳酸菌,检测其体外活性。为了给优化制备的纳米硒乳酸菌找到更好的应用场景,初步探索其对四种代表性疫苗的免疫提升效果。之后根据试验结果以及场地原因,建立小鼠模型进行试验,疫苗免疫前,试验组小鼠分别口服乳酸菌、纳米硒乳酸菌、初步纯化的纳米硒,以及注射热灭活纳米硒乳酸菌,测定小鼠抗体水平变化、攻毒保护情况、肠道病理切片观察、氧化损伤情况、炎症和硒蛋白相关基因的表达情况等指标判定其对铝佐剂灭活疫苗免疫效果的影响。为了更加清晰地显示其免疫增强效果,我们又设置了纳米硒乳酸菌提升1/4剂量、1/2剂量疫苗免疫效果的小鼠模型试验。最后,在家兔(本动物)上进一步验证其在临床中提升疫苗免疫的效果。主要结果如下:(1)在乳酸菌23017培养至对数期初期,加入30μg/mL的亚硒酸钠,亚硒酸钠转化率最高,达到78.4%,并可实现1 L制备。经过优化制备的纳米硒乳酸菌相较于乳酸菌具有更强的ABTS自由基清除能力,羟自由基清除能力,DPPH自由基清除活性以及清除超氧阴离子能力。纳米硒乳酸菌在4℃冷藏条件下保存7个月后,依然能够达到微生物制剂活菌数标准。(2)纳米硒乳酸菌可提高新城疫LaSota(Ⅳ)系活疫苗、猪丹毒活疫苗(GC42株)、猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)、兔产气荚膜梭菌病(A型)灭活疫苗的抗体效价,提升灭活疫苗的攻毒保护效果更明显。(3)根据试验结果及综合考虑,选用兔产气荚膜梭菌灭活疫苗病(A型)为代表的铝佐剂灭活疫苗进行进一步评价。建立乳酸菌、纳米硒乳酸菌、热灭活纳米硒乳酸菌、初步纯化的纳米硒提升小鼠免疫铝佐剂灭活疫苗效果的模型,取得的主要结果如下:纳米硒乳酸菌、热灭活纳米硒乳酸菌、粗制纳米硒可提高小鼠免疫铝佐剂灭活疫苗后的抗体水平,效果优于乳酸菌;添加乳酸菌、纳米硒酸菌、热灭活纳米硒乳酸菌、粗制纳米硒可明显改善免疫小鼠攻毒后的临床症状;攻毒使免疫小鼠体重大幅度减轻,乳酸菌、纳米硒酸菌、热灭活纳米硒乳酸菌、粗制纳米硒可有效减缓免疫小鼠体重下降;病理切片结果显示,乳酸菌、纳米硒酸菌、热灭活纳米硒乳酸菌、粗制纳米硒可有效缓解免疫小鼠攻毒引起的肠道损伤。(4)纳米硒乳酸菌可以上调硒蛋白相关功能基因(GPx1、GPx2、GPx3、GPx4、SelH、SelI、SelW、SelT、SelO、Sephs2、Sepp1、Sep15、DIO1)mRNA的表达水平;乳酸菌、纳米硒酸菌、热灭活纳米硒乳酸菌、粗制纳米硒有利于疫苗免疫和攻毒后小鼠体内氧化-抗氧化系统平衡的恢复;乳酸菌、纳米硒酸菌、热灭活纳米硒乳酸菌、粗制纳米硒可调控疫苗免疫以及攻毒后小鼠体内炎症相关因子的失衡。(5)热灭活纳米硒乳酸菌可以提升1/4剂量、1/2剂量疫苗免疫小鼠的血清特异性IgG抗体水平,降低1/2剂量疫苗免疫小鼠攻毒后的死亡率。(6)家兔模型试验结果显示,纳米硒乳酸菌可以提升免疫家兔的血清特异性IgG抗体水平,提升免疫家兔的中和抗体水平,显著降低DAI评分,有效减轻免疫家兔感染A型产气荚膜梭菌α毒素引起的肠道损伤。以上结果显示,优化制备纳米硒乳酸菌,进一步提高了乳酸菌的无机硒转化率。纳米硒乳酸菌可以显著提升铝佐剂灭活疫苗免疫小鼠效果,并且可能与调节氧化应激水平、影响硒蛋白相关功能基因的表达水平存在关联。同时,纳米硒乳酸菌可以显著提升铝佐剂灭活疫苗免疫家兔(本动物)的效果,为更好地应用纳米硒乳酸菌提供新思路。

关键词：纳米硒乳酸菌疫苗铝佐剂免疫效果攻毒保护