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基于铁蛋白自组装技术的PPRV-H纳米颗粒抗原的表达及初步评价

基于铁蛋白自组装技术的PPRV-H纳米颗粒抗原的表达及初步评价

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作者：李丹中国农业科学院

学位级别：硕士

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性、接触性疾病,我国已经将其列为Ⅰ类传染病。该病主要通过减毒活疫苗进行防控,但其存在安全性问题、且不能通过血清学检查区分自然感染与疫苗免疫动物,... 详细信息

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性、接触性疾病,我国已经将其列为Ⅰ类传染病。该病主要通过减毒活疫苗进行防控,但其存在安全性问题、且不能通过血清学检查区分自然感染与疫苗免疫动物,为PPR疫情防控带来困难。铁蛋白可以组装为球形纳米结构,将融合的抗原蛋白展示于其表面,促进抗原被抗原呈递细胞识别、摄取,进而诱导更强的免疫反应,且其具有稳定性强、毒性低、生物相容性好等优势,成为新型纳米疫苗研究的良好抗原呈递载体。小反刍兽疫病毒血凝素蛋白(Hemagglutinin,H)作为病毒表面的主要免疫原,是PPR亚单位疫苗研制的首选抗原蛋白。本研究选用实验室前期优化合成的H蛋白(Gen Bank登录号为AJE30413.1)及幽门螺旋杆菌铁蛋白(Ferritin,Fe;Gen Bank登录号为NP＿223316)基因,通过Linker(SGG)序列将H蛋白连接在Fe蛋白N端,分别在大肠杆菌和家蚕杆状病毒表达系统中表达,利用铁蛋白自组装技术组装成纳米颗粒抗原,对其免疫原性进行测定,研究结果如下:将血凝素蛋白H基因及H-Fe融合基因克隆至原核表达载体p ET28a His标签下游,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株获得表达,经纯化后得到H及H-Fe蛋白约为2 mg/L及17 mg/L。重组蛋白主要以包涵体形式存在,需通过透析复性法使其形成高级结构。经负染及金粒子标记后在透射电镜下观察到融合蛋白H-Fe组装为大小约为30 nm的球形颗粒,且H蛋白位于球形结构表面。将H及H-Fe蛋白免疫小鼠,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测到35 d时H蛋白组血清抗体效价约为1:10,而H-Fe组则达到1:10左右,表明铁蛋白融合H蛋白形成的球形纳米结构可以提高H蛋白的免疫原性。中和抗体检测发现,两组血清抗体对PPRV病毒均具有中和作用,中和效价在1:20-1:40之间。将H及H-Fe基因克隆至杆状病毒转移载体p VL1393多角体启动子下游,重组杆状病毒转移载体与杆状病毒基因组DNA共转染Bm N细胞,收获重组病毒并在家蚕中表达。利用ELISA法检测到H及H-Fe表达量分别为0.8 mg/m L及1.2 mg/m L,较原核表达系统表达效率高。重组蛋白H-Fe经负染及金粒子标记后在透射电镜中观察到30 nm左右的球形颗粒,且H蛋白位于球形结构表面,表明家蚕作为一种真核表达系统不需进行复杂的变性复性等操作,表达的H-Fe蛋白能够自组装为球形纳米结构。将H及H-Fe蛋白免疫小鼠,35 d时,H蛋白组血清抗体效价约为1:10,H-Fe组则达到1:10左右。进一步经中和抗体检测发现,35 d时H蛋白组血清中和抗体滴度约为1:80左右,H-Fe组高达1:160。表明融合铁蛋白与H蛋白形成的纳米颗粒抗原提高了H蛋白的免疫原性,为铁蛋白用于PPR疫苗研制提供了理论依据。本研究首次利用铁蛋白自组装特性对PPR疫苗进行研究,利用大肠杆菌表达系统及家蚕杆状病毒表达系统表达抗原并对其免疫活性进行检测。结果表明,铁蛋白可以作为一种良好的抗原呈递载体提高H蛋白的免疫原性,为PPR疫苗的研制提供了新的方法。另外,相比于原核表达系统来说,家蚕杆状病毒表达系统由于其外源蛋白表达量高、且具有一系列翻译后修饰功能,有望成为一种高效的PPRV疫苗研究平台。

关键词：小反刍兽疫血凝素蛋白铁蛋白自组装杆状病毒表达系统纳米颗粒抗原

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SARS-CoV-2中和性纳米抗体在家蚕中的表达及中和活性检测

SARS-CoV-2中和性纳米抗体在家蚕中的表达及中和活性检测

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作者：王海宁江苏科技大学

学位级别：硕士

新型冠状病毒病(corona virus disease 2019,COVID-19)的病原是严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2),病毒通过S蛋白上的受体结合域RBD与细胞受体ACE2结合进入细胞,感染人体后能够引起包括呼吸道疾病在内的全身损伤。纳米抗体(nanobody,Nb)作为小分子抗体的成员之一,与传统的抗体相比免疫原性更弱、穿透性更强、稳定性更好且对抗原的亲和力更高,针对S蛋白的纳米抗体可以特异性靶向新冠病毒S蛋白的受体结合域RBD,阻止其与细胞膜受体ACE2结合。铁蛋白(Ferritin)能够自组装形成天然的蛋白纳米笼,在蛋白展示、抗原呈递、药物靶向输送等方面具有良好的应用前景,将纳米抗体与铁蛋白相融合,利用其自组装的特性,使纳米抗体以24聚体的形式展示在铁蛋白表面,可以提高纳米抗体对S蛋白的靶向亲和力从而提高其中和活性。本研究选取SARS-CoV-2的中和性纳米抗体H11-D4,通过Linker与人的铁蛋白重链C端连接,分别利用大肠杆菌和家蚕杆状病毒表达系统表达重组蛋白H11-D4、Fe-H11-D4,并通过假病毒中和试验检测目的蛋白的中和活性,具体研究内容如下:将SARS-CoV-2中和性纳米抗体H11-D4基因与人铁蛋白重链基因优化合成后克隆至原核表达载体p ET28a上,转化至Rosetta(DE3)菌株中表达,获得目的蛋白H11-D4、Fe-H11-D4。纯化后获得的H11-D4、Fe-H11-D4产量分别为25.16mg/L、8.70mg/L。透析复性后透射电镜观察到铁蛋白融合H11-D4能自组装为20nm左右的球状结构,H11-D4展示在铁蛋白的表面。将复性后的目的蛋白进行假病毒中和试验,结果表明H11-D4与Fe-H11-D4可以阻止假病毒进入细胞,具有中和假病毒的能力,IC分别为171.10nmol/L和20.87nmol/L,与铁蛋白融合表达的纳米抗体中和活性明显高于单独表达的纳米抗体,证明铁蛋白表面多聚纳米抗体提高了对S蛋白的靶向亲和力。将H11-D4和Fe-H11-D4基因克隆到杆状病毒转移载体p BR上,与失活拯救型杆状病毒DNA共转染家蚕Bm-N细胞,获得重组杆状病毒re Bam Bac-H11-D4、re Bam Bac-Fe-H11-D4,将其感染家蚕后收集蚕血淋巴,用ELISA检测到Fe-H11-D4的表达量为101.23μg/m L。将Fe-H11-D4进行超离纯化后电镜观察,可以观察到铁蛋白-纳米抗体融合蛋白Fe-H11-D4在家蚕中自组装成20nm左右的天然球型结构,H11-D4展示在铁蛋白的表面。通过假病毒中和试验测得蚕血淋巴中H11-D4、Fe-H11-D4的中和滴度分别为1:1226、1:2080。根据蚕血淋巴中Fe-H11-D4蛋白的浓度计算出Fe-H11-D4的IC=1.46nmol/L,IC显著高于原核表达的Fe-H11-D4,证明蚕血淋巴表达的融合蛋白中和活性高于原核纯化复性后的铁蛋白融合蛋白的中和活性,体现了家蚕杆状病毒对外源蛋白翻译后加工修饰的优势。本研究将纳米抗体与铁蛋白融合表达,基于铁蛋白自组装的特性,利用大肠杆菌和杆状病毒表达系统将纳米抗体以24聚体的形式展示在铁蛋白表面,实验结果显示利用铁蛋白展示多聚的纳米抗体可以显著提高纳米抗体对S蛋白的靶向亲和力从而提高其中和活性。且杆状病毒表达系统具有翻译后加工修饰的功能,因此可以将铁蛋白纳米笼展示多聚蛋白的功能得以最大程度的利用,这为建立一种低成本、高中和活性的新冠病毒诊断和治疗药物奠定了一定的基础。

关键词：新冠病毒纳米抗体铁蛋白自组装家蚕杆状病毒表达系统

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