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钙调素与靶蛋白结合模式的多样性

化学进展 2012年第10期24卷 2028-2039页

作者：冯业丹魏群北京师范大学生命科学学院、北京市基因工程药物及生物技术重点实验室北京100875

钙调素(CaM)通过与数百种靶蛋白结合,调节众多钙信号通路参与的生理活动。钙调素与靶蛋白的结合模式也是多种多样的,数年前就有多篇这方面的综述发表,最近的一篇发表于2006年。这之后的5、6年,又有大量钙调素-靶蛋白复合体的结构以及新... 详细信息

钙调素(CaM)通过与数百种靶蛋白结合,调节众多钙信号通路参与的生理活动。钙调素与靶蛋白的结合模式也是多种多样的,数年前就有多篇这方面的综述发表,最近的一篇发表于2006年。这之后的5、6年,又有大量钙调素-靶蛋白复合体的结构以及新型的结合模式发表,这其中就包括本实验室发表的钙调素与钙调蛋白磷酸酶(CN)的钙调素结合区(CBD)结合的晶体结构,为不同于经典模式的X形二聚体。本文在前人综述的基础上,结合本实验室的成果,以及其他近5、6年新发表的结构,从经典包围型、其他包围型、伸展型、IQ基序相关、二聚体型、大分子参与的结合模式共6个类别,讨论了30多种钙调素-靶蛋白复合体的结构。这些多样的结合模式为钙调素调节功能的多样性提供了结构基础,也为解析结构未知的钙调素-靶蛋白复合体提供了启示。

关键词：钙调素靶蛋白钙调素-靶蛋白复合体蛋白结构钙调蛋白磷酸酶

谷胱甘肽复方注射液对免疫性肝纤维化大鼠肝组织钙调素表达的影响

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中华肝脏病杂志 2019年第8期27卷 628-633页

作者：刘俊英刘洋李涵时朝辉梁祖兰王玲慧张钰赵媛范玉梅吴斌于彦章河南省周口市中心医院 466000

目的探讨免疫性肝纤维化大鼠肝组织中抗衰老标志蛋白钙调素(RGN)的表达变化,并观察谷胱甘肽复方注射液(CGII)对其的影响。方法应用猪血清腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型,适时给予CGII干预。取大鼠肝组织行HE及Masson染色。荧光定量PCR和... 详细信息

目的探讨免疫性肝纤维化大鼠肝组织中抗衰老标志蛋白钙调素(RGN)的表达变化,并观察谷胱甘肽复方注射液(CGII)对其的影响。方法应用猪血清腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型,适时给予CGII干预。取大鼠肝组织行HE及Masson染色。荧光定量PCR和免疫组化检测肝组织中RGNmRNA及蛋白质表达。计量资料采用单因素方差分析,两两比较采用LDS检验,病理学半定量结果采用秩和检验分析。结果纤维化组大鼠肝组织RGNmRNA相对表达量为82.23±15.21及蛋白表达相对表达量为12.52±3.23,较正常组RGNmRNA(176.39±11.35)及蛋白水平(59.23±9.13)明显降低(P值均0.05)。结论RGN在猪血清所致大鼠肝纤维化肝组织表达降低,而CGII干预后随着纤维化程度的减轻,RGN的表达增加,提示该蛋白可能在肝纤维化发生发展过程中起重要作用。

关键词：大鼠免疫性肝纤维化钙调素谷胱甘肽复方注射液

钙调素拮抗剂EBB抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞骨转移和增殖活动的作用

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中国临床研究 2019年第2期32卷 154-157,161页

作者：金科杨林朱剑梅赵丹四川省医学科学院四川省人民医院城东病区肿瘤科四川成都610101 四川省医学科学院四川省人民医院城东病区创伤外科四川成都610101

目的通过体外实验探讨钙调素(regucalcin)拮抗剂抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞骨转移和增殖活动的作用。方法体外培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞,取对数生长期的细胞,分为对照组、实验1组、实验2组[分别以fenbieyi regucalcin拮抗剂O-... 详细信息

目的通过体外实验探讨钙调素(regucalcin)拮抗剂抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞骨转移和增殖活动的作用。方法体外培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞,取对数生长期的细胞,分为对照组、实验1组、实验2组[分别以fenbieyi regucalcin拮抗剂O-(4-乙氧基)-丁基-小檗胺(EBB) 10μmol/L、1μmol/L进行处理]。采用MTT法检测肿瘤细胞增殖抑制作用; Transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验检测肿瘤细胞侵袭,转移情况;流式细胞仪测定细胞周期;免疫印迹法测定骨转移相关蛋白(P38、JNK、AKT)表达情况。结果 MTT检测显示EBB能够抑制MDA-MB-231细胞的生长,且当剂量增加时这种抑制作用更加显著,MDA-MB-231细胞的半数抑制浓度(IC50)为(13. 22±2. 10)μmol/L。实验1组与实验2组的细胞划痕愈合率为(67. 03±3. 63)%和(72. 01±5. 20)%,明显少于空白对照组的(92. 22±5. 39)%(P 0. 05)。实验1组与实验2组的JNK、AKT蛋白相对表达量明显低于对照组(P 0. 05)。结论钙调素拮抗剂EBB能明显抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞骨转移和增殖活动,调节细胞周期,也能抑制成骨相关蛋白的表达。

关键词：钙调素拮抗剂人乳腺癌细胞骨转移细胞周期

钙调素与重金属Pb^(2+)结合反应的方波极谱与循环伏安法研究

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高等学校化学学报 2009年第11期30卷 2154-2158页

作者：刘德龙吴彦环郭慧芳白娟孙大业河北师范大学化学学院石家庄050016 河北师范大学生命科学学院石家庄050016

采用方波极谱法研究了重金属Pb2+与钙调素(CaM)的结合反应,直接检测到Pb2+-CaM配合物的存在,并进一步利用循环伏安法研究了Pb2+-CaM的电极反应.在pH=6.5时,用方波极谱法在Pb2+-CaM体系中检测出2个还原峰,峰电位分别为-0.44^-0.47 V和-0.... 详细信息

采用方波极谱法研究了重金属Pb2+与钙调素(CaM)的结合反应,直接检测到Pb2+-CaM配合物的存在,并进一步利用循环伏安法研究了Pb2+-CaM的电极反应.在pH=6.5时,用方波极谱法在Pb2+-CaM体系中检测出2个还原峰,峰电位分别为-0.44^-0.47 V和-0.73^-0.77 V,说明在Pb2+-CaM体系中铅有2种存在形式,-0.44^-0.47 V的还原峰对应于游离态Pb2+,电位更负的还原峰对应于配合物[Pb2+-CaM].2个还原峰的峰电流均随着cPb2+/cCaM比值增大而增大;至cPb2+/cCaM≥10后,配合物[Pb2+-CaM]的峰电流基本不再变化,而游离态Pb2+的峰电流则继续增大.利用极谱滴定曲线的拐点可判断出Pb2+在CaM中有10个结合位点.进一步的测量结果表明,循环伏安曲线出现游离态Pb2+的氧化峰和还原峰,而络合态的[Pb2+-CaM]只有其还原峰,反向电压扫描时不出现阳极波,即没有相对应的氧化峰出现.

关键词：钙调素重金属离子Pb2+ 结合位点方波极谱法循环伏安法

钙-钙调素信号途径参与低钾胁迫下烟草幼苗吸钾机制研究

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钙-钙调素信号途径参与低钾胁迫下烟草幼苗吸钾机制研究

作者：徐高强河南农业大学

学位级别：硕士

钾是植物需求量最多的营养元素之一,它能够直接参与多种生理生化反应,也是烟草公认的品质元素。但由于我国植烟土壤普遍存在缺钾及钾肥利用效率低等问题,严重影响我国烟叶钾含量,因此研究低钾胁迫下调控烟株钾吸收的关键因子具有重要意... 详细信息

钾是植物需求量最多的营养元素之一,它能够直接参与多种生理生化反应,也是烟草公认的品质元素。但由于我国植烟土壤普遍存在缺钾及钾肥利用效率低等问题,严重影响我国烟叶钾含量,因此研究低钾胁迫下调控烟株钾吸收的关键因子具有重要意义。大量研究表明钙信号是植株低钾胁迫信号传导的主要因素之一,同时也是影响植株根系对钾素吸收转运的重要物质。钙调蛋白(Ca M)是一种重要的钙离子传感器,可通过结合钙离子形成Ca-Ca M复合体,该复合物可通过调节下游靶蛋白的活性,参与生物和非生物胁迫。本研究以烟草品种K326为供试材料进行室内水培试验,主要研究了:(1)低钾胁迫下不同钙离子浓度对烟草幼苗生长发育及钾吸收的影响;(2)低钾胁迫下钙信号抑制剂对烟草幼苗光合特性及钾吸收的影响;(3)低钾胁迫下钙调素拮抗剂对烟草幼苗光合特性及钾吸收的影响。主要研究结果如下:1.不同钙离子浓度可显著影响低钾幼苗的生长发育及钾吸收。无论何种钙离子浓度下,常钾处理烟株地上部及根系鲜重和干重、叶片及根系可溶性蛋白含量、根系活力、抗氧化酶活性及各部位钾含量均明显高于低钾水平;相同钾水平下随着钙离子浓度的不断增加,烟株各部位干鲜重、生理特性、钾含量的变化规律表现为先升高后降低。低钾植株生长状况、根系和叶片生理特征及钾含量均以钙离子浓度为5 mmol/L时达到峰值,其中烟株根系钾含量与其它处理相比显著升高,最大值为7.323 mg/g。水培溶液钙离子浓度较低时可促进植物生长发育和钾吸收,浓度较高时则产生抑制效果。二者关系表现为拮抗作用,当水培溶液钙浓度为5 mmol/L时,最有利于烟草生长发育和钾素吸收积累。2.钙信号抑制剂加剧低钾胁迫对烟草幼苗光合特性及钾吸收的影响。低钾胁迫下,添加钙通道抑制剂或螯合剂处理的叶片相对电导率、烟株体内活性氧积累量均显著增加,烟株体内抗氧化酶活性及根系抗氧化酶相关基因的表达量、叶绿素含量、根系NADPase含量、根系及叶片钙离子含量、根系钙调素含量显著减少,光合特性指标(除水汽压饱和亏外)明显降低。低钾胁迫下,添加钙通道抑制剂或螯合剂处理的烟株地上部及根系钾含量显著低于对照,且平均降低幅度分别达到25.54%和53.36%。在低钾根系中钾离子通道基因NKT2、Nt KC1及转运蛋白基因Nt HAK1、Nt HAK5的相对表达量分别平均降低了60.60%、50.62%、38.61%、69.79%,根中钙通道相关基因Nt CNGC3和Nt CNGC10的相对表达量分别平均降低了85.26%和87.38%。低钾胁迫下,3个钙抑制处理可通过降低根系活力、抗氧化酶活性和相关基因的相对表达量以及阻碍烟株叶绿素的合成和光合作用等,进而抑制根中钾吸收相关基因的表达和烟株对钾素的吸收。3.钙调素拮抗剂加剧低钾胁迫对烟草幼苗光合特性及钾吸收的影响。低钾水平下,外源施加钙调素拮抗剂后,植株各部位钾含量、抗氧化酶活性、叶绿素含量及光合特性6项指标(除水汽压饱和亏外)明显降低。低钾胁迫下,与未添加钙调素拮抗剂相比,钙调素拮抗剂处理的叶片钙调素含量、植株各部位钾含量、根系钾吸收相关基因表达量、叶绿素总含量及光合特性6项指标(除水汽压饱和亏外)、叶片钙调素含量显著降低,其中植株地上部及根系钾含量平均降低了23.69%和60.00%,根系中NKT2、Nt KC1、Nt HAK1、Nt HAK5、Nt CNGC3、Nt CNGC10基因的相对表达量平均降低了82.84%、94.18%、52.44%、86.55%、64.29%、48.88%。低钾胁迫下添加钙调素拮抗剂会抑制钙调素含量,阻碍Ca-Ca M复合体的形成,影响信号传导,导致叶片抗氧化酶活性及光合作用降低,根系中K+吸收相关基因的表达量减少,抑制植株K+吸收和积累。

关键词：烟草低钾钙浓度钙信号钙调素光合特性钾吸收

钙调素及其抗血清对梨花粉萌发和花粉管生长的影响

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江苏农业学报 2016年第2期32卷 437-441页

作者：周建涛姜雪婷李慧蔺经张绍铃江苏省农业科学院园艺研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室江苏南京210014 南京农业大学梨工程技术研究中心江苏南京210095

以砂梨品种今村秋及丰水为试验材料,在离体及活体条件下,研究了外源施加不同浓度钙调素及其抗血清对梨花粉萌发及花粉管生长的影响。离体培养条件下,施加10^(-7)mol/L钙调素对今村秋花粉萌发及花粉管生长的促进作用最明显,而稀释200倍... 详细信息

以砂梨品种今村秋及丰水为试验材料,在离体及活体条件下,研究了外源施加不同浓度钙调素及其抗血清对梨花粉萌发及花粉管生长的影响。离体培养条件下,施加10^(-7)mol/L钙调素对今村秋花粉萌发及花粉管生长的促进作用最明显,而稀释200倍的钙调素抗血清则有明显的抑制作用。自交不亲和性反应与活体试验结果进一步证实钙调素在梨花粉萌发与花粉管生长过程的促进作用,而钙调素抗血清的作用与之截然相反,显著抑制花粉萌发及花粉管生长。说明,钙调素处理可以有效促进梨自交不亲和过程花粉萌发及花粉管生长。

关键词：钙调素梨自交不亲和花粉特性

钙调素在生长相关蛋白-43调控细胞周期中的作用

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解剖学报 2012年第3期43卷 340-346页

作者：程蓓赵君朋徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病重点实验室北京100069

目的探讨钙调素-43(CaM)在生长相关蛋白(-43)(GAP-43)调控细胞周期过程中的作用。方法利用反转录病毒体系构建表达不同活性状态的GAP-43(即野生型、非磷酸化型和假磷酸化型GAP-43)NIH3T3细胞模型,并分别命名为表达野生型GAP-43(3T3-G)... 详细信息

目的探讨钙调素-43(CaM)在生长相关蛋白(-43)(GAP-43)调控细胞周期过程中的作用。方法利用反转录病毒体系构建表达不同活性状态的GAP-43(即野生型、非磷酸化型和假磷酸化型GAP-43)NIH3T3细胞模型,并分别命名为表达野生型GAP-43(3T3-G)、表达非磷酸化GAP-43(3T3-A)和表达假磷酸化GAP-43(3T3-D);另设对照组(转染空载体NIH3T3细胞)。通过免疫组织化学及Western blotting鉴定各型细胞模型转入GAP-43的情况;应用免疫共沉淀检测各型GAP-43与CaM的功能关系;应用细胞生长曲线、BrdU累积标记法、BrdU脉冲标记法测定各型转GAP-43细胞的细胞周期。结果免疫组织化学和Western blotting结果显示,NIH3T3细胞能够表达转入的各型GAP-43。其中,3T3-A细胞增殖速度较其他细胞减缓。免疫共沉淀显示,3T3-A中有GAP-43和CaM相互作用表现;3T3-G中GAP-43和CaM有少量相互作用;3T3-D与3T3-P中则相互作用。累积BrdU测定,脉冲BrdU测定M期的实验表明,3T3-P细胞无明显周期改变;3T3-D与3T3-G细胞的周期延长;3T3-A细胞的周期明显延长并显示G1期明显延长。结论表达GAP-43的细胞其增殖表现可能是由于GAP-43结合了CaM,使之与Ca2+的结合减少而引起细胞周期(尤其是G1期)的延长。

关键词：生长相关蛋白-43 NIH3T3细胞钙调素细胞周期 BrdU 免疫印迹法免疫组织化学

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盐藻钙调素基因的克隆及表达分析

水产科学 2021年第3期40卷 409-415页

作者：王明芳高相楠徐微微丛玉婷柴晓杰大连海洋大学辽宁省省级高校水生生物学重点实验室辽宁大连116023

为探究盐藻钙调素基因的结构与功能,利用RT-PCR和RACE技术克隆到盐藻钙调素基因(DsCaM,GenBank登录号:MN428415),并对其进行生物信息学分析,通过qRT-PCR方法检测盐藻钙调素在盐胁迫条件下的表达情况。试验结果显示,盐藻钙调素基因cDNA全... 详细信息

为探究盐藻钙调素基因的结构与功能,利用RT-PCR和RACE技术克隆到盐藻钙调素基因(DsCaM,GenBank登录号:MN428415),并对其进行生物信息学分析,通过qRT-PCR方法检测盐藻钙调素在盐胁迫条件下的表达情况。试验结果显示,盐藻钙调素基因cDNA全长1061 bp,开放阅读框495 bp,编码164个氨基酸。盐藻钙调素为亲水蛋白,该蛋白主要分布在细胞质和液泡内,无跨膜区域,不存在信号肽,蛋白质的二级结构以α-螺旋(56.71%)和无规则卷曲(26.22%)为主,成功构建蛋白质三级结构。系统进化分析表明,盐藻钙调素基因与莱茵衣藻钙调素基因亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,在高盐胁迫下盐藻钙调素基因的表达量显著上调,胁迫6 h时表达量达到最高值,差异达到极显著水平(P钙调素基因的功能及盐藻应答盐胁迫信号的分子途径提供新信息。

关键词：盐藻钙调素 qRT-PCR 生物信息学分析

百脉根钙调素家族蛋白（LjCaMs）体外活性检测

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百脉根钙调素家族蛋白（LjCaMs）体外活性检测

作者：陈杨晗四川农业大学

学位级别：硕士

生命体生长发育需要氮。人工固氮会造成多种环境问题,而生物固氮更高效环保。豆科植物根瘤共生固氮体系(NFS)是最主要也是最突出的生物固氮。当根瘤菌侵染宿主植物后,会引起根表皮细胞细胞核周围Ca发生震荡。这种震荡产生的信号需要依赖... 详细信息

生命体生长发育需要氮。人工固氮会造成多种环境问题,而生物固氮更高效环保。豆科植物根瘤共生固氮体系(NFS)是最主要也是最突出的生物固氮。当根瘤菌侵染宿主植物后,会引起根表皮细胞细胞核周围Ca发生震荡。这种震荡产生的信号需要依赖钙/钙调素蛋白激酶(CCaMK)解码。CCaMK只有在机体内的Ca浓度发生变化且同时有钙调素(CaM)存在时才会被激活并参与调控NFS形成。植物中广泛存在CaMs多基因家族并编码不同的蛋白亚型,且不同的CaMs蛋白具有不同的生物学特性和功能。因此,本研究以百脉根(Lotus japonicus(Regel)K.Larsen)的钙调素家族蛋白为研究对象,探讨其体外生物学活性的多样性。主要实验结果如下:1)通过定点突变技术获得CCaMK与ccamk-14条带并构建其原核表达载体。用1 mmol/L的IPTG在28°C进行诱导表达,上清中存在一条与理论值大小相符的特异蛋白条带(57 kDa左右),表明在该温度下成功表达。收集菌体超声破碎,离心后取上清纯化,使用BCA试剂盒测定纯化后的蛋白浓度,CCaMK为415.1μg/mL,CCaMK为474.7μg/mL。2)1 mmol/L IPTG、37°C、9 h表达pET28-a(+)-LjCaMs并纯化。发现不同的LjCaMs被EGTA完全洗脱的浓度以及与Ca的结合能力均不相同。当纯化后LjCaMs为9μg时,采用50μL的反应体系,发现LjCaM1和LjCaM3能被0.1μmol的EGTA完全洗脱,LjCaM2被0.05μmol的EGTA完全洗脱,而LjCaM4在EGTA达到0.2μmol时才能被完全洗脱。此外,完全洗脱后的LjCaMs结合Ca的能力也不一致。当LjCaMs为9μg时,采用50μL的反应体系,发现LjCaM1在Ca为1.25μmol时便达到饱和,LjCaM2在Ca为1.4μmol时达到饱和,LjCaM3在Ca为2.5μmol时还未达到饱和,而LjCaM4在Ca浓度为2μmol时达到饱和。因此,各个LjCaMs完全结合Ca的能力大小为LjCaM3>LjCaM4>LjCaM2>LjCaM1。3)将LjCaMs与CCaMK/CCaMK进行体外互作检测,结果表明利用原核表达的重组蛋白CCaMK/CCaMK不能直接与LjCaMs互作。猜测可能是因为反应缓冲液中的Ca浓度不足或是CCaMK未磷酸化,需要加大反应缓冲液中的Ca浓度以及将CCaMK磷酸化后再进一步实验。4)在拟南芥原生质体中进行LjCaMs与CCaMK和ccamk-14的双分子荧光互补检测。证明LjCaMs与CCaMK、CCaMK均能相互作用。LjCaM1与CCaMK互作后的结合蛋白主要分布在原生质体的质膜上,在细胞质上存在少量分布,LjCaM2与CCaMK互作后的结合蛋白在原生质体的质膜、叶绿体膜、细胞核以及细胞质上都有分布,和LjCaM3与CCaMK互作后的结合蛋白在原生质体的质膜及细胞质上都有分布,而LjCaM4与CCaMK互作后的结合蛋白分布在原生质体的质膜以及叶绿体膜上;而LjCaM1和LjCaM4与CCaMK的相互作用发生在质膜和细胞质中;LjCaM2与CCaMK的相互作用发生在质膜、叶绿体膜及细胞质上;LjCaM3与CCaMK的相互作用发生在质膜、细胞质和细胞核中。这说明了CCaMK的突变会影响其与钙调素的结合。

关键词：百脉根钙调素依赖钙/钙调素蛋白激酶原核表达钙离子双分子荧光互补