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钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白表达与瓣膜性房颤发生的关系

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钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白表达与瓣膜性房颤发生的关系

作者：张庆山东大学

学位级别：硕士

研究背景心房纤颤是心脏瓣膜病患者的常见并发症,除了可使患者心功能降低20-30%外,还有一最大的危害就是脑栓塞。房颤根据病因可分为瓣膜性房颤和非瓣膜性房颤,有数据显示,非瓣膜性房颤病人发生脑栓塞的危险性是无房颤者的5-7倍,而瓣膜... 详细信息

研究背景心房纤颤是心脏瓣膜病患者的常见并发症,除了可使患者心功能降低20-30%外,还有一最大的危害就是脑栓塞。房颤根据病因可分为瓣膜性房颤和非瓣膜性房颤,有数据显示,非瓣膜性房颤病人发生脑栓塞的危险性是无房颤者的5-7倍,而瓣膜性房颤病人则可高达17倍。因此,研究瓣膜性房颤发生机制对预防脑栓塞发生具有重要意义。已知,钙调神经磷酸酶(Calcineurin, CaN)信号通路与房颤的发生有一定相关性,CaN活性增高会导致房颤的发生。该CaN信号通路机制是否也适用于瓣膜性房颤?近期完成的几项研究从基因水平对此进行了探讨,发现瓣膜性房颤患者外周血及心肌组织中CaN mRNA水平均明显高于瓣膜病不合并房颤者。钙蛋白酶-2是一种蛋白水解酶,对CaN活性的调节起重要作用。激活的钙蛋白酶-2可使CaN水解,CaN全长分子(相对分子质量为60KD)失去自抑区后变成结构上的活化形式(45KD片段)。另有研究表明,钙蛋白酶-2 mRNA水平在心肌组织中也有相同的趋势。提示CaN信号通路也参与了瓣膜性房颤的发生。关于该二种重要酶在瓣膜病患者的蛋白表达情况目前尚未见报道。本课题将对此进行研究观察。研究目的探讨钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶(CaN)蛋白表达与瓣膜病患者房颤发生的关系。研究方法选取因瓣膜病住院接受瓣膜置换手术的患者40例,搜集其术前心电图、超声心动图等临床资料,根据心电图所示的心律状况分为窦性心律组(n=17)和房颤组(n=23)。以外科换瓣手术时取下的右心耳心肌组织为研究标本,用Western blot方法检测钙蛋白酶-2和CaN催化亚基(CnA) a异构体的蛋白表达水平,以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照,所得条带灰度值比值的结果作为各蛋白表达的相对含量。研究结果1.两组患者一般临床资料的比较：两组患者的年龄、性别、体质指数、吸烟史、饮酒史、血压、血红蛋白方面差异均无统计学意义(P均>0.05);但房颤组患者心率明显高于窦性心律组,其差异具有统计学意义(P0.05)。3.两组患者超声心动图检查结果：与窦性心律组相比,房颤组左房内径明显增大,其差异具有统计学意义(P0.05)。4.两组样本心肌组织钙蛋白酶-2蛋白表达的比较：经内参照β-actin蛋白校正后,房颤组钙蛋白酶-2蛋白表达水平显著高于窦性心律组,其差异具有统计学意义(0.82±0.44 vs 0.51±0.19,P蛋白表达的比较：经内参照β-actin蛋白校正后,CaN催化亚基CnA的全长分子(60KD)在房颤组中有高表达,与窦性心律组相比,其差异具有统计学意义(0.76±0.37 vs 1.25±0.51,P蛋白表达水平显著高于窦性心律组,其差异具有统计学意义(1.08±0.37 vs 0.76±0.25,P钙蛋白酶-2-CaN信号通路可能参与了瓣膜性房颤的发生。

关键词：瓣膜病房颤钙蛋白酶-2 钙调神经磷酸酶蛋白表达

钙蛋白酶-2对基孔肯雅病毒复制的影响及其作用机制研究

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钙蛋白酶-2对基孔肯雅病毒复制的影响及其作用机制研究

作者：李佳南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景及目的基孔肯雅热是基孔肯雅病毒感染所致,由白纹伊蚊和埃及伊蚊传播的一种虫媒传染病。我国早在1987年就报道了首例基孔肯雅热。迄今为止,世界上约有39%的人口居住在有基孔肯雅病毒流行的国家和地区,面临着被感染的风险。随着... 详细信息

研究背景及目的基孔肯雅热是基孔肯雅病毒感染所致,由白纹伊蚊和埃及伊蚊传播的一种虫媒传染病。我国早在1987年就报道了首例基孔肯雅热。迄今为止,世界上约有39%的人口居住在有基孔肯雅病毒流行的国家和地区,面临着被感染的风险。随着生态环境和气候条件的改变,全球气候变暖的趋势更加明显,埃及伊蚊和白蚊伊蚊活动范围逐渐扩大,国际经贸和文化的来往愈发频繁,基孔肯雅病毒在全球范围内的扩散速度越来越快,极有可能对更多新的国家和地区造成威胁。但目前,基孔肯雅病毒感染细胞的受体尚未阐明,感染后所致关节症状的致病机制不甚清楚,同时针对基孔肯雅热仍没有特异的药物和疫苗。因此,本研究拟通过分析基孔肯雅病毒感染前后钙蛋白酶-2的表达差异及其活性变化,同时通过抑制钙蛋白酶-2的表达和活性水平,确定钙蛋白酶-2是否能影响基孔肯雅病毒的复制,探索其作用机制,以期能够为探究基孔肯雅病毒的致病机制打下理论基础,为基孔肯雅热的防控和治疗提供科学依据。研究方法1.将基孔肯雅病毒分别感染细胞和小鼠,通过实时荧光定量PCR和钙蛋白酶活性检测试剂盒,分别检测细胞和小鼠内钙蛋白酶-2的表达和活性水平。2.用基孔肯雅病毒感染经抑制剂inhibitor Ⅲ作用后的Hela细胞,通过实时荧光定量PCR和空斑形成实验,分别检测细胞内基孔肯雅病毒E1基因的表达量和细胞上清内基孔肯雅病毒的滴度。3.用基孔肯雅病毒感染已转染钙蛋白酶-2特异性小干扰RNA的Hela细胞,通过实时荧光定量PCR和空斑形成实验,分别检测细胞内基孔肯雅病毒的表达量和细胞上清内基孔肯雅病毒的滴度。4.用基孔肯雅病毒感染经抑制剂inhibitor Ⅲ和钙蛋白酶-2特异性小干扰RNA作用的Hela细胞,通过蛋白印迹实验分别检测细胞内波形蛋白和微管蛋白的表达水平。5.用基孔肯雅病毒感染经抑制剂inhibitor Ⅲ作用后的Hela细胞,通过免疫荧光技术分别观察细胞内波形蛋白和微管蛋白的分布情况。研究结果1.基孔肯雅病毒的感染对细胞以及小鼠关节、肌肉组织内钙蛋白酶-2的表达和活性无显著影响。2.钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ作用后,能显著降低Hela细胞内基孔肯雅病毒的复制水平和细胞上清中基孔肯雅病毒的滴度。3.钙蛋白酶-2特异性小干扰RNA沉默钙蛋白酶-2基因的表达后,能显著降低Hela细胞内基孔肯雅病毒的复制水平和细胞上清中基孔肯雅病毒的滴度。4.钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ和特异性小干扰RNA对Hela细胞内波形蛋白和微管蛋白的表达水平无显著影响。5.基孔肯雅病毒感染Hela细胞后,波形蛋白出现绕细胞核收紧聚拢的重排现象,且钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ能够抑制此现象。6.基孔肯雅病毒感染Hela细胞后,微管蛋白边缘出现轻微的绕细胞核收拢现象,但钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ对此现象没有明显的影响。结论本研究发现,基孔肯雅病毒感染对钙蛋白酶-2的表达和活性无显著影响,但钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ和特异性小干扰RNA能显著抑制Hela细胞内基孔肯雅病毒的复制和细胞上清中的病毒滴度,表明钙蛋白酶-2对于基孔肯雅病毒的复制至关重要。同时,钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ和特异性小干扰RNA对细胞内波形蛋白和微管蛋白的表达水平没有明显影响。除此之外,钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ对细胞内微管蛋白轻微地向细胞核收紧的现象没有明显影响,但可以抑制细胞内波形蛋白因基孔肯雅病毒感染而出现的绕细胞核聚拢的重排现象,这可能是钙蛋白酶-2影响基孔肯雅病毒复制的机制之一,对于理解基孔肯雅病毒复制的生物学意义以及抗病毒策略的未来发展至关重要。

关键词：基孔肯雅病毒钙蛋白酶-2 波形蛋白微管蛋白病毒复制

风湿性心房颤动患者左心房组织中钙蛋白酶-2的表达

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山东大学学报（医学版） 2014年第4期52卷 93-96页

作者：韩波王建春张涛朱小龙李丛王正军赵勇邹承伟潍坊医学院山东潍坊261053 山东大学附属省立医院心脏外科山东济南250021

目的观察风湿性心房颤动(AF)患者左心房中钙蛋白酶-2(calpain-2)的表达,探讨其在AF发病机制中的作用。方法选取外科换瓣手术的风湿性心脏病患者39例,分为窦性心律组(n=16例)和心房颤动组(n=23例)。应用RT-PCR技术和免疫组化LSAB法半定... 详细信息

目的观察风湿性心房颤动(AF)患者左心房中钙蛋白酶-2(calpain-2)的表达,探讨其在AF发病机制中的作用。方法选取外科换瓣手术的风湿性心脏病患者39例,分为窦性心律组(n=16例)和心房颤动组(n=23例)。应用RT-PCR技术和免疫组化LSAB法半定量检测calpain-2的表达。结果心房颤动组calpain-2 mRNA的deltaCt值高于窦性心律组[(0.091±0.035)vs(0.066±0.022),P=0.017];两组左心房心肌细胞中均有棕黄色颗粒沉着,心外膜和心内膜细胞均未见棕黄色颗粒;心房颤动组中calpain-2表达含量明显高于窦性心律组(P2±0.17和0.65±0.01;calpain-2的含量与左心房收缩末期直径呈正相关(r=0.929,P2在人类左心房心肌细胞中表达;AF时calpain-2的表达明显增加。

关键词：心房颤动钙蛋白酶-2 半胱氨酸蛋白酶钙蛋白酶-2抑制剂 Calpain-2

酸敏感离子通道1a通过调节钙蛋白酶-2/钙调神经磷酸酶通路来介导酸化诱导的大鼠关节软骨细胞的焦亡

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酸敏感离子通道1a通过调节钙蛋白酶-2/钙调神经磷酸酶通路来介导...

作者：祖胜芹安徽医科大学

学位级别：硕士

类风湿性关节炎(RA)是一种伴随着关节软骨退化的慢性系统性自身免疫性疾病,细胞焦亡作为其发生的一个原因而备受关注。前期研究结果表明在大鼠关节软骨细胞中胞外酸化能通过激活NLRP3炎症小体来介导软骨细胞发生焦亡。然而,胞外酸化诱... 详细信息

类风湿性关节炎(RA)是一种伴随着关节软骨退化的慢性系统性自身免疫性疾病,细胞焦亡作为其发生的一个原因而备受关注。前期研究结果表明在大鼠关节软骨细胞中胞外酸化能通过激活NLRP3炎症小体来介导软骨细胞发生焦亡。然而,胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞发生焦亡的具体机制目前尚不清楚。酸敏感离子通道属于一类阳离子通道,由胞外酸化所激活的。大量文献研究表明:在关节炎中,胞外酸化能够通过激活ASICs上调calpain和calcineurin的表达。研究表明:calpain、calcineurin与细胞焦亡密切相关,而软骨细胞胞外酸化过程中是否存在着ASIC1a介导的细胞焦亡,以及ASIC1a是否是通过调节calpain-2、calcineurin蛋白的表达来参与细胞焦亡目前尚不清楚。本课题通过体外实验研究胞外酸化是否是通过激活ASIC1a来介导大鼠关节软骨细胞发生焦亡,同时观察calpain-2/calcineurin通路在此过程中发挥的作用。本课题的研究内容主要分为以下四个方面:1.体外实验研究胞外酸化对ASIC1a,calpain,calcineurin和NLRP3炎症小体的影响。关节软骨细胞分组如下:(1)分别用含1%FBS的pH7.4、pH7.0、pH6.5和pH6.0的培养基培养各组细胞6h。(2)pH7.4正常组、pH6.0胞外酸化1h组、胞外酸化3h组、胞外酸化6h组、胞外酸化12h组和胞外酸化24h组,酸化刺激相应的时间后来收集细胞。结果表明:用不同pH酸化刺激软骨细胞6h,pH6.0条件下ASIC1a蛋白表达增加得最为显著。用pH6.0酸化刺激软骨细胞6h时ASIC1a蛋白表达达到最大值。qpcr结果显示:用pH6.0酸化刺激软骨细胞12h时calpain-1、calpain-2、calcineurin mRNA表达增加得最为显著。Western blot结果显示:用pH6.0酸化刺激软骨细胞12h时calpain-1、calpain-2、calcineurin蛋白表达与mRNA表达结果一致。qpcr结果显示:用pH6.0酸化刺激软骨细胞24h时NLRP3、ASC、caspase-1mRNA表达增加得最为显著。Western blot结果显示:用pH6.0酸化刺激软骨细胞24h时NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达与mRNA表达结果一致。以上结果表明:胞外酸化刺激可以显著上调ASIC1a、calpain、calcineurin和NLRP3炎症小体的表达。2.体外实验研究关节软骨细胞中沉默和阻断ASIC1a对胞外酸化刺激的calpain-2、calcineurin和细胞焦亡的影响。关节软骨细胞分组如下:pH7.4正常组、pH6.0酸化组、pH6.0+空质粒对照组、pH6.0+ASIC1a沉默组和pH6.0+Pctx-1(100ng/ml)组(ASIC1a特异性的抑制剂),细胞经过相应处理后再使用pH6.0的培养基酸化处理6h。实验结果表明ASIC1a shRNA处理关节软骨细胞6h时,细胞内ASIC1a、calpain-2、calcineurin、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达明显受到抑制。AO/EB结果显示,pH7.4的正常组细胞死亡数较少,pH6.0酸化组软骨细胞被染成橘黄色,着色细胞比例增加,细胞死亡明显增多,用ASIC1a shRNA处理可以明显抑制软骨细胞死亡。LDH结果显示,pH7.4的正常组细胞释放的LDH较少,pH6.0酸化组LDH释放显著增加,control shRNA组LDH释放与pH6.0酸化组无差异,用ASIC1a shRNA和PcTX1处理可以明显抑制LDH的释放。ELISA结果显示,pH7.4的正常组细胞分泌的IL-1β较少,pH6.0酸化组IL-1β分泌显著增加,control shRNA组IL-1β分泌与pH6.0酸化组无差异,用ASIC1a shRNA和Pc TX1处理可以明显抑制IL-1β的分泌。以上结果表明:阻断ASIC1a能够抑制胞外酸化刺激的calpain-2,calcineurin蛋白表达的升高以及酸化刺激诱导的关节软骨细胞的焦亡。3.体外实验研究关节软骨细胞中沉默和阻断calpain-2对胞外酸化刺激的calcineurin和细胞焦亡的影响。关节软骨细胞分组如下:pH7.4正常组、pH6.0酸化组、pH6.0+空质粒对照组、pH6.0+calpain-2沉默组和pH6.0+calpain-2抑制剂calpeptin组,细胞经过相应处理后再使用pH6.0的细胞培养基酸化处理12h。实验结果表明calpain-2 shRNA处理关节软骨细胞12h时,细胞内calpain-2、calcineurin、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达明显受到

关键词：酸化酸敏感离子通道钙蛋白酶-2 钙调神经磷酸酶炎症小体细胞焦亡大鼠关节软骨细胞

风湿性心脏病心房颤动患者左心房组织中钙蛋白酶-2含量与心肌细胞凋亡的相关性

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潍坊医学院学报 2015年第3期37卷 164-167页

作者：林浩韩波王勇朱小龙马晓春梁飞张凯邹承伟潍坊医学院外科学教研室山东潍坊261053 山东大学附属省立医院心脏外科济南第四人民医院

目的检测风湿性心脏病心房颤动(房颤,AF)患者左房心肌细胞中钙蛋白酶-2(calpain-2)的表达水平及左房心肌细胞凋亡的发生率,探讨二者之间的关系和在AF发病机制中的作用。方法选择行外科心脏瓣膜置换手术的风湿性心脏病患者47例,分为窦性... 详细信息

目的检测风湿性心脏病心房颤动(房颤,AF)患者左房心肌细胞中钙蛋白酶-2(calpain-2)的表达水平及左房心肌细胞凋亡的发生率,探讨二者之间的关系和在AF发病机制中的作用。方法选择行外科心脏瓣膜置换手术的风湿性心脏病患者47例,分为窦性心律(NSR)组(20例)和心房颤动(AF)组(27例)。应用荧光实时定量PCR和免疫组织化学法半定量检测calpain-2的表达;利用TUNEL法检测各组患者左房心肌细胞凋亡率。计算其凋亡指数(AI),应用相关性分析分别分析其与前两者之间的关系。结果 AF组中calpain-2 mRNA[deltaCt值:(0.088±0.033)vs(0.065±0.020),P蛋白表达量[平均光密度值:(0.091±0.017)vs(0.062±0.007),P2的mRNA转录水平与心房肌细胞凋亡率呈明显正相关(r=0.688,P2的蛋白含量与心房肌细胞凋亡呈明显正相关(r=0.801,P2蛋白的表达水平增高,细胞凋亡率升高,两者可能互相影响,致使心房重构,进而推动房颤的发生,可能是心房颤动形成的重要机制之一。

关键词：心房颤动钙蛋白酶-2 细胞凋亡半胱氨酸蛋白酶

钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白表达与瓣膜性房颤发生的关系

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中西医结合心脑血管病杂志 2018年第23期16卷 3515-3517页

作者：李勤佛山市第二人民医院广东佛山528000

目的探究钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)蛋白表达与心脏瓣膜病病人发生心房颤动的关系。方法入选因心脏瓣膜病住院接受瓣膜置换手术的病人48例,搜集术前心电图、超声心动图等临床资料,根据心电图结果分为窦性心律组(22例... 详细信息

目的探究钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)蛋白表达与心脏瓣膜病病人发生心房颤动的关系。方法入选因心脏瓣膜病住院接受瓣膜置换手术的病人48例,搜集术前心电图、超声心动图等临床资料,根据心电图结果分为窦性心律组(22例)房颤组与(26例)。在心脏瓣膜置换手术时切取右心耳心肌组织,用蛋白质印迹法(Western blot)测定病人心肌组织钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶(CaN)蛋白表达水平,以β-肌动蛋白(β-actin)为参照,所得条带灰度值比值作为蛋白表达的相对含量,再结合形态学检查及其他指标检查结果以确定两种蛋白表达与瓣膜性房颤发生的关系。结果两组年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、血压及血红蛋白含量指标差异均无统计学意义(P>0.05),但房颤组心率高于窦性心律组(P 0.05);房颤组心胸比例、二尖瓣瓣口面积明显高于窦性心律组,差异具有统计学意义(P 0.05);房颤组心肌组织钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白表达水平均高于窦性心律组(P 钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白的表达可能影响了心脏及心脏瓣膜正常的形态学结构,进而引发了瓣膜性房颤。

关键词：房颤瓣膜性房颤钙蛋白酶-2 钙调神经磷酸酶心脏形态学心血管压力

钙蛋白酶及其抑制蛋白在女性压力性尿失禁患者尿道周围组织中的表达

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全科医学临床与教育 2016年第2期14卷 131-134,139,F0002,F0003页

作者：杨春波赵彦侠金杭美浙江大学医学院附属妇产科医院妇四科浙江杭州310006 山东省聊城市东昌府区妇幼保健院妇科

目的分析钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白在压力性尿失禁(SUI)患者尿道周围组织中的表达及定位,探讨两者在压力性尿失禁发病中起的作用。方法选取20例行阴道无张力尿道中段悬吊术的SUI患者(SUI组)和20例行阴道壁囊肿剥除术的非SUI患者(对照... 详细信息

目的分析钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白在压力性尿失禁(SUI)患者尿道周围组织中的表达及定位,探讨两者在压力性尿失禁发病中起的作用。方法选取20例行阴道无张力尿道中段悬吊术的SUI患者(SUI组)和20例行阴道壁囊肿剥除术的非SUI患者(对照组),采用免疫组化En Vision染色法对两组患者尿道周围组织石蜡切片中钙蛋白酶-1、钙蛋白酶-2和钙蛋白酶抑制蛋白的表达区域及水平进行检测。结果 SUI组和对照组尿道周围组织中的上皮细胞、平滑肌细胞中均有钙蛋白酶-1、钙蛋白酶-2和钙蛋白酶抑制蛋白的表达,但间质细胞中未见这三种蛋白的表达。钙蛋白酶-1的表达水平在SUI组和对照组上皮细胞和平滑肌细胞中的表达分别为2.71±0.45 vs2.41±0.41,2.01±0.40 vs 2.09±0.43,两组间比较,差异均无统计学意义(t分别=1.80、-0.46,P均>0.05)。钙蛋白酶-2的表达水平在SUI组和对照组上皮细胞和平滑肌细胞中的表达分别为3.07±0.36 vs 2.67±0.47,2.50±0.42 vs 2.08±0.51,两组间比较,差异均有统计学意义(t分别=2.35、2.28,P均钙蛋白酶抑制蛋白的表达水平在SUI组和对照组上皮细胞和平滑肌细胞中的表达分别为2.91±0.42 vs 3.23±0.39,2.69±0.43 vs 3.09±0.45,两组间比较,差异均有统计学意义(t分别=-2.19、-2.35,P均钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白表达失衡可能参与压力性尿失禁的发生,钙蛋白酶-2对SUI的发病有促进作用,钙蛋白酶抑制蛋白对SUI的发病有保护作用。

关键词：压力性尿失禁钙蛋白酶-1 钙蛋白酶-2 钙蛋白酶抑制蛋白

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麻醉诱导的小鼠晶状体突发性浑浊

解剖学杂志 2013年第3期36卷 279-281,308,F0002页

作者：曹妍群于慧敏尚蕾罗佳黄菊芳陈旦王慧中南大学基础医学院人体解剖学与神经生物学系长沙410013 邵阳医学高等专科学校人体解剖学教研室邵阳422000

目的：探讨各种麻醉剂对小鼠晶状体透明度的影响及可能机制。方法：分别用10％水合氯醛（400mg／kg）、2％戊巴比妥钠（40mg／kg）及25％乌拉坦（1000mg／kg）腹腔注射麻醉C57／BL6小鼠，扩瞳后于10、20、30、45、60min裂隙灯观察晶状... 详细信息

目的：探讨各种麻醉剂对小鼠晶状体透明度的影响及可能机制。方法：分别用10％水合氯醛（400mg／kg）、2％戊巴比妥钠（40mg／kg）及25％乌拉坦（1000mg／kg）腹腔注射麻醉C57／BL6小鼠，扩瞳后于10、20、30、45、60min裂隙灯观察晶状体浑浊情况，于麻醉60min后断颈处死，H-E染色观察晶状体组织学变化，免疫荧光检测晶状体上皮细胞钙蛋白酶-2及水通道蛋白-1（AQP1）的表达。结果：乌拉坦、水合氯醛麻醉组与戊巴比妥钠麻醉组相比，麻醉持续时间较长，晶状体出现浑浊的时间较早，浑浊程度较重；麻醉后可见晶状体前囊膜增厚，上皮细胞呈增生性变化，上皮细胞钙蛋白酶-2表达增强，AQP1表达减弱。结论：麻醉剂可导致小鼠晶状体突发性浑浊，与上皮细胞上钙蛋白酶-2活性表达增加及AQP1活性表达减少有密切关系。

关键词：麻醉晶状体钙蛋白酶-2 水通道蛋白-1

前扣带回KCC2下调参与SMIR介导的大鼠慢性术后疼痛

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前扣带回KCC2下调参与SMIR介导的大鼠慢性术后疼痛

作者：朱鹏霞郑州大学

学位级别：硕士

研究背景慢性术后疼痛(chronic post-surgical pain,CPSP)已日趋成为重要的健康问题。慢性术后疼痛发生率高,严重影响患者预后情况,延长住院时间,增加医疗支出,降低患者术后生活质量,因此,如何更好的预防和治疗慢性术后疼痛问题亟待解... 详细信息

研究背景慢性术后疼痛(chronic post-surgical pain,CPSP)已日趋成为重要的健康问题。慢性术后疼痛发生率高,严重影响患者预后情况,延长住院时间,增加医疗支出,降低患者术后生活质量,因此,如何更好的预防和治疗慢性术后疼痛问题亟待解决。外周损伤引起中枢敏化是慢性疼痛的主要机制,研究表明前扣带回(anterior cingulate cortex,ACC)作为疼痛激活最重要的大脑皮质,接受来自脊髓背角的疼痛信号传递,介导疼痛的发生和发展。ACC抑制性传递功能降低(去抑制)在慢性疼痛中发挥重要作用,去抑制导致兴奋性投射神经元兴奋性增加,疼痛传递信号传导增加。而中枢投射神经细胞兴奋性增加主要依靠钾氯共转运蛋 2(potassium chloride co-transporter 2,KCC2),KCC2 是中枢神经系统内氯离子平衡的主要调控蛋白,KCC2可以将Cl-转运出细胞外,维持细胞内低浓度的Cl-,从而维持GABA受体和甘氨酸受体介导的突触抑制。当KCC2表达下调时,会导致神经细胞内C1蓄积,Cl-通过GABAA受体转运出细胞,神经细胞由超极化转变为去极化,细胞兴奋性增加,疼痛信号传递增加,导致慢性疼痛。研究发现,大脑皮层中钙蛋白酶(Calpain)可调控KCC2的表达,增强中枢神经元的兴奋性和疼痛信号传递增加介导大鼠癫痫、神经病理性疼痛的发生和维持。但是,前扣带回(ACC)中KCC2下调是否参与慢性术后疼痛的发生和发展,目前尚无明确报道。研究目的本研究选用大鼠皮肤/肌肉切开牵拉术(skin/muscle incision and retraction,SMIR)介导的慢性术后疼痛模型,探究前扣带回(ACC)KCC2在慢性术后疼痛中的作用及相关分子机制。实验方法1大鼠ACC中KCC2在皮肤/肌肉切开牵拉(SMIR)术后的表达变化及其细胞分布类型雄性SD采用随机数字表法分为3组(n=8):实验组(SMIR组)、假手术组(Sham 组)和对照组(Naive 组),术前 3 d(Baseline)、SMIR 术后 1-32 d测量三组大鼠后足机械性撤足阈值(Paw withdrawal threshold,PWT)和热缩足潜伏期(Paw withdrawal latency,PWL),利用 qRT-PCR(n=4)和 Western Blot(n=6)技术检测前扣带回(ACC)中KCC2的转录水平以及蛋白表达水平的变化情况。利用免疫荧光技术检测ACC中KCC2的表达变化及细胞分布类型。2 ACC中KCC2在SMIR介导的大鼠慢性术后疼痛中的作用雄性SD大鼠采用随机数字表法分为4组(n=8):Na(?)ve组、SMIR组、SMIR-AAV-CON 组和 SMIR-AAV-KCC2 组。SMIR-AAV-CON 组和 SMIR-AAV-KCC2组大鼠SMIR术前4 w时行左侧前扣带回(L-ACC)原位显微注射腺相关病毒对照、腺相关病毒(AAV2/9-Null 过表达对照、AAV2/9-CMV-r-Slc12a5-HA-Null)。利用免疫荧光技术检测L-ACC中腺相关病毒转染和KCC2的表达变化。利用qRT-PCR(n=4)和Western Blot(n=6)技术检测左侧前扣带回(L-ACC)中KCC2的转录水平以及蛋白表达水平的变化情况。于病毒注射前后、SMIR前3 d和SMIR后1-25 d时测量PWT值,进一步验证ACC中KCC2在慢性术后痛中的作用。3 ACC中Calpain-2调控KCC2参与大鼠慢性术后疼痛的分子机制采用Western Blot(n=6)技术检测SMIR术后痛模型大鼠L-ACC中Calpain-2蛋白水平的表达变化。雄性SD大鼠随机分为4组(n=8):Na(?)ve+Saline组、SMIR 组、SMIR+Vehicle 组和 SMIR+MDL28170 组。Na(?)ve+Vehicle 组、SMIR+Vehicle组和SMIR+MDL28170组大鼠SMIR术前5 d行大鼠鞘内置管术,并在SMIR后第12 d鞘内注射DMSO、钙蛋白酶抑制剂MDL28170。于鞘内注射抑制剂后1h、2h、4h、8h、12h和24h测量PWT值,采用Western B1Ot(n=6)技术检测注射钙蛋白酶抑制剂8 h后大鼠L-ACC中KCC2和Calpain-2蛋白水平的表达变化。免疫荧光技术检测Calpain-2的表达情况以及KCC2与Calpain-2的共定位情况。实验结果1 SMIR引起大鼠L-ACC中的KCC2和KCC2mRNA的表达下调痛行为学数据显示,与Naive组相比,SMIR组大鼠PWT于SMIR术后1 d时开始下降,12 d时PWT最低,PWT于SMIR术后32 d恢复术前基础值;而PW

关键词：慢性术后疼痛前扣带回钾氯共转运蛋白钙蛋白酶-2