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生物化学与生物物理进展 2015年第4期42卷 337-347页

作者：张庆杨慧李佳谢欣李静华东师范大学科学与技术跨学科高等研究院上海200062 中国科学院上海药物研究所国家新药筛选中心上海201203

G蛋白偶联受体84(GPR84)是C9-C14的中链脂肪酸受体,不仅在脂肪酸代谢和机体免疫反应中发挥着重要作用,而且与多发性硬化症、内毒素血症等炎症性免疫疾病有着密切联系.因此,找到以GPR84为靶点的配体,可能为治疗这些疾病提供一种有效的方... 详细信息

G蛋白偶联受体84(GPR84)是C9-C14的中链脂肪酸受体,不仅在脂肪酸代谢和机体免疫反应中发挥着重要作用,而且与多发性硬化症、内毒素血症等炎症性免疫疾病有着密切联系.因此,找到以GPR84为靶点的配体,可能为治疗这些疾病提供一种有效的方法.构建稳定过表达GPR84受体蛋白的细胞系,为筛选GPR84为靶点的配体和研究这些免疫疾病提供了重要途径.本文将含GPR84和Gα16基因质粒共转染到HEK293细胞中,经过抗生素抗性筛选,挑取稳定表达GPR84蛋白的HEK293细胞系.用RT-PCR、免疫荧光染色等实验方法检测了GPR84基因和其编码受体蛋白的表达;用钙流实验、环腺苷酸实验、蛋白质印迹分析、流式细胞分析证实了表达的GPR84具有完整的生物学活性,并利用该细胞系进行了药物高通量筛选,得到了新的GPR84拮抗剂,为进一步阐明GPR84的生物学功能,研究并治疗与其相关免疫疾病奠定了基础.

关键词： GPR84 稳定表达钙流实验高通量筛选

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猪胸腺活化调节趋化因子CCL17的趋化和钙流功能研究

猪胸腺活化调节趋化因子CCL17的趋化和钙流功能研究

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作者：刘龙飞西北农林科技大学

学位级别：硕士

胸腺活化调节因子CCL17（ Thymus Activation Regulating Chemokine CCL17）是趋化因子CC家族成员之一。在自身免疫性疾病、炎症反应等疾病过程中发挥重要作用。研究猪CCL17基本功能,有助于开发CCL17潜在应用价值。尤其在高致病性猪蓝... 详细信息

胸腺活化调节因子CCL17（ Thymus Activation Regulating Chemokine CCL17）是趋化因子CC家族成员之一。在自身免疫性疾病、炎症反应等疾病过程中发挥重要作用。研究猪CCL17基本功能,有助于开发CCL17潜在应用价值。尤其在高致病性猪蓝耳病方面,可能具有广阔的前景。在优化CCL17原核表达条件的基础上,对包涵体进行上清诱导,纯化猪CC17原核蛋白,采用钙流实验和趋化试验对其活性进行检测。结果表明,猪CCL17原核蛋白具有和真核蛋白类似的生物学活性,具有进一步研究价值。本研究主要内容与结果如下: 1.猪CCL17原核蛋白的诱导纯化对蛋白进行诱导表达时发现,蛋白表达以包涵体为主,根据包涵体形成原因:1、蛋白表达太快来不及折叠（与培养基营养浓度和细菌生存环境中的氧气浓度有关）;2、重组蛋白的氨基酸组成（客观原因无法改变）;3、表达温度（该蛋白改变温度不表达）。将培养基浓度降为正常浓度的80%对猪CCL17进行上清诱导,上清表达浓度可以满足蛋白过柱纯化需要,可避免包涵体纯化率低、操作繁琐的缺点。由于小分子蛋白原核蛋白和真核蛋白结构和功能差异不大,所以本实验同时也为原核蛋白纯化及原核蛋白代替真核蛋白进行蛋白功能研究打下基础。 2.猪CCL17原核蛋白对3D4/31株猪单核细胞系的趋化实验根据CCL17可以诱导活化单核细胞发生变形,产生伪足,使得其沿着CCL17低浓度到高浓度迁徙这一特点,我们设计1000 ng/mL,100 ng/mL,10 ng/mL,1 ng/mL和0.1 ng/mL五个梯度的CCL17对3D4/31株猪单核细胞系活性进行检测。结果表明,高剂量和低剂量CCL17都没有促迁移作用,只有在浓度为1000 ng/mL和100 ng/mL的CCL17才对3D4/31株猪单核细胞系有趋化作用。为此,我们通过梯度实验进行最适浓度筛选。结果趋化指数大于2,实验数据有意义。 3.猪CCL17原核蛋白对3D4/31株猪单核细胞系的钙流实验根据CCL17可以与3D4/31株猪单核细胞系表面G蛋白偶联受体CCR4结合,从而激活钙离子通道,使得细胞外钙离子内流入细胞浆这一特性,利用钙流实验对其活性进行检测。根据趋化实验筛选数据,CCL17在1 000 ng/mL和100 ng/mL对3D4/31株猪单核细胞系活性最强。取趋化实验的阳性浓度进行钙流实验,发现CCL17在1 000 ng/mL和100 ng/mL对3D4/31株猪单核细胞系有明显的刺激钙离子内流的功能,可以观测到阳性组细胞内荧光亮度明显高于对照组。

关键词：猪CCL17 原核蛋白纯化趋化实验钙流实验

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重组人巨噬细胞炎症蛋白3α（MIP-3α）的克隆、原核表达及功能鉴定

重组人巨噬细胞炎症蛋白3α（MIP-3α）的克隆、原核表达及功能鉴...

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作者：顾涛第三军医大学

学位级别：硕士

巨噬细胞炎症蛋白3α(Macrophage inflammatory protein 3-α,MIP-3α),是趋化因子(Chemokine)超家族成员。主要由表皮细胞或粘膜上皮细胞分泌的一类CC族趋化因子,特异性趋化郎格罕细胞(Langerhans Cells,LC)向表皮或粘膜上皮迁移。已... 详细信息

巨噬细胞炎症蛋白3α(Macrophage inflammatory protein 3-α,MIP-3α),是趋化因子(Chemokine)超家族成员。主要由表皮细胞或粘膜上皮细胞分泌的一类CC族趋化因子,特异性趋化郎格罕细胞(Langerhans Cells,LC)向表皮或粘膜上皮迁移。已知LC是皮肤中最重要的抗原递呈细胞,决定了皮肤组织的免疫反应特征,是异体皮肤移植后发生免疫排斥的主要原因;同时MIP-3α也具有趋化未成熟树突状细胞(DC)和淋巴细胞的功能,在炎症和肿瘤发生中起重要作用。作为趋化因子的重要的组成部份,越来越受到人们的关注。目前对MIP-3α的研究尚处于初步阶段。为此我们克隆了人MIP-3α成熟蛋白基因,构建了该基因的原核表达质粒,进行了重组蛋白的诱导表达、纯化及生物学活性的鉴定,旨在为进一步研究MIP-3α在肿瘤发展与转移、移植排斥反应和自身免疫性疾病中的作用机制及应用奠定基础,并且并以此为基础,获得多个MIP-3 alpha突变体蛋白,再从突变体中寻找具有拮抗CCR6活性的蛋白,然后在小鼠模型上观察,拮抗CCR6对减轻炎症的发生、降低皮肤排斥反应等方面的影响。该项研究取得的主要结果如下: 1.从人扁桃体中提取RNA,RT-PCR成功获得编码人MIP-3α成熟蛋白的DNA片段,并将该片段插入原核表达质粒pET32a(+),成功构建了重组原核表达质粒pET32a(+)/MIP-3α(+3),通过突变去掉目的基因与肠激酶位点间的三个氨基酸,经测序,与GenBank上登录的人MIP-3α成熟蛋白cDNA序列完全一致,获得MIP-3α天然蛋白的重组原核表达质粒pET32a(+)/MIP-3α。 2.将该质粒转化大肠杆菌BL21trxB(DE3),经IPTG诱导,获得了高水平表达的融合蛋白(TrxA- MIP-3α),并确定融合蛋白在BL21trxB(DE3)中高效表达的最佳诱导条件为终浓度0.2mmol/L的IPTG在18℃诱导表达15小时。SDS-PAGE分析可见,表达蛋白的大小约为25KD,占菌体总蛋白的30%以上,可溶性蛋白约占总融合蛋白的50%。 3.将大量表达的融合蛋白经TALON金属亲和树脂纯化、除盐、强阳离子交换层析、再除盐、肠激酶消化、弱阳离子交换层析,得到高纯度的MIP-3α重组蛋白。纯化后的蛋白在SDS-PAGE上呈现单一条带。

关键词： MIP-3α 原核表达蛋白纯化趋化实验钙流实验

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以中链脂肪酸受体GPR84为靶点的药物高通量筛选模型的建立和应用

以中链脂肪酸受体GPR84为靶点的药物高通量筛选模型的建立和应用

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作者：张庆华东师范大学

学位级别：硕士

G蛋白偶联受体84(GPR84)是C9-C14的中链脂肪酸受体,不仅在脂肪酸代谢和机体免疫反应发挥着重要作用,而且与肠炎、多发性硬化症、内毒素血症等炎症性免疫疾病有着密切联系。由于GPR84是一种促进炎症发生的受体,因此,找到以GPR84为靶点的... 详细信息

G蛋白偶联受体84(GPR84)是C9-C14的中链脂肪酸受体,不仅在脂肪酸代谢和机体免疫反应发挥着重要作用,而且与肠炎、多发性硬化症、内毒素血症等炎症性免疫疾病有着密切联系。由于GPR84是一种促进炎症发生的受体,因此,找到以GPR84为靶点的拮抗剂,可能为治疗这些疾病提供一种有效的方法。迄今为止针对G蛋白偶联受体常用的药物筛选方法有两种,一种是针对受体的配体竞争结合实验,另外一种是依赖于GPCR下游信号通路(如cAMP, Ca2+)的功能性实验。在GPCR激活后,可以活化Gαq亚基中的Gα16,通过一系列的信号转导后,可以升高胞内肌醇三磷酸(IP3)的浓度,继而引起内质网膜上的钙离子释放,通过检测胞质中钙离子浓度的变化,可以推断出受体被激活的水平。本文将含GPR84和Gα16基因质粒共转染到HEK293细胞中,经过抗生素抗性筛选,挑取稳定表达GPR84蛋白的HEK293细胞系。用RT-PCR、免疫荧光染色等实验方法检测了GPR84基因和其编码受体蛋白的表达;用钙流实验、cAMP实验、Western blot实验、FACS实验证实了表达的GPR84具有完整的生物学活性,并利用该细胞系进行了药物高通量筛,得到了新的GPR84拮抗剂,为进一步阐明GPR84的生物学功能,研究并治疗与其相关免疫疾病奠定了基础。建立HEK293/GPR84/ Gα16稳转细胞系。方法：将编码GPR84和Gα16蛋白的质粒电转至HEK293细胞之中,利用抗生素抗性筛选28天,选择稳定生长的单克隆扩大培养,得到单克隆之后,利用RT-PCR和免疫荧光染色的实验方法检测了外源基因和表达的受体蛋白,结果：RT-PCR和免疫荧光染色均检测到GPR84蛋白的表达,证明获得的细胞系膜表面稳定表达GPR84受体。检测获得的HEK293/GPR84/Gα16稳转细胞系上GPR84活性及功能。方法：利用钙流实验、cAMP实验和Western blot实验的方法检测GPR84的配体6-OAU对本细胞株上稳定表达的GPR84具有激动作用;利用钙流实验、FACS实验和免疫荧光染色实验检测了在6-OAU刺激后,本细胞株膜表面上的GPR84受体脱敏,并发生内吞现象。结果：GPR84能被6-OAU呈剂量依赖性地激活,说明建立的稳转细胞系膜表面上的GPR84具有完整的生物学功能。建立高通量钙流筛选模型及其应用。方法：(1)高通量钙流模型分为两种模型：激动剂模型及拮抗剂模型,即可分别评价6-OAU和小分子化合物对GPR84受体的作用;(2)应用拮抗剂模型检测了国家化合物样品库中的一系列化合物对GPR84的作用。结果：6-OAU能剂量依赖地激活趋化因子受体GPR84,在激动剂模型中检测到显著的钙离子变化信号,而应用拮抗剂模型,筛选小分子化合物能否抑制6-OAU引起的钙离子变化,初步得到了对趋化因子受体GPR84有一定拮抗作用的化合物ZQ-02,并验证了该化合物对GPR84的拮抗活性和特异性。

关键词： GPR84 G蛋白偶联受体稳定表达拮抗剂钙流实验高通量筛

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新型NK1受体拮抗剂的合成及生物活性研究

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华西药学杂志 2019年第4期34卷 332-336页

作者：和龙向洪刚刘新琦温晓燕王玲欧阳亮何俊北京宽厚医药科技有限公司北京102600 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室四川成都610041

目的制备一类新型N-甲基-N-(4-(2-苯甲基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-3-吡啶基)苯甲酰胺衍生物,并评价其对NK1受体的体外拮抗活性。方法以6-(4-甲基-1-哌嗪基)-4-(2-甲基苯基)烟酰胺为起始原料,经过霍夫曼降解、酰胺还原和N-酰化等化学反应... 详细信息

目的制备一类新型N-甲基-N-(4-(2-苯甲基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-3-吡啶基)苯甲酰胺衍生物,并评价其对NK1受体的体外拮抗活性。方法以6-(4-甲基-1-哌嗪基)-4-(2-甲基苯基)烟酰胺为起始原料,经过霍夫曼降解、酰胺还原和N-酰化等化学反应得到目标化合物;采用钙流实验,在HEK293/NK1R细胞株上进行体外对NK1受体拮抗活性的测定。结果制备了13个新型化合物(Ⅰ1~Ⅰ13),并经1HNMR确证结构。化合物Ⅰ12对HEK293/NK1R细胞有较好的NK1受体拮抗活性。结论化合物Ⅰ12作为一类新型NK1受体拮抗剂,具有深入研究的价值。

关键词： N-甲基-N-(4-(2-苯甲基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-3-吡啶基)苯甲酰胺衍生物合成生物活性 NK1受体钙流实验 HEK293/NK1R细胞株拮抗活性

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人趋化因子受体CCR6的克隆、表达及其功能分析

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重庆医学 2006年第18期35卷 1663-1665页

作者：沈大斌龚小云顾涛罗福康郑红第三军医大学西南医院综合实验研究中心重庆400038

目的构建人趋化因子受体6(CCR6)cDNA序列的真核表达载体,并在HEK293细胞中表达,为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段,并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建重... 详细信息

目的构建人趋化因子受体6(CCR6)cDNA序列的真核表达载体,并在HEK293细胞中表达,为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段,并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CCR6;将该质粒pcDNA3.1(+)-CCR6转染HEK293细胞,用流式细胞术检测转染pcDNA3.1(+)-CCR6质粒的HEK293细胞;采用体外趋化实验、钙流实验,验证转染pcDNA3.1(+)-CCR6质粒的HEK293细胞表面表达的CCR6的生物学活性。结果经RT-PCR获得了编码人CCR6受体的DNA片段,构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CCR6;转染HEK293细胞,经流式细胞仪检测、趋化实验、钙流实验证实,表达CCR6的HEK293细胞具有趋化因子受体CCR6的生物学活性。结论重组人趋化因子受体CCR6克隆成功,并在HEK293细胞中获得了表达,为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6拮抗剂奠定了基础。

关键词：人趋化因子受体6 pcDNA3.1(+) 趋化实验钙流实验克隆

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