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钙池操纵性钙通道抑制剂SKF96365对慢性哮喘小鼠气道重塑和气道高反应性的作用

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内科急危重症杂志 2018年第3期24卷 248-252页

作者：曹欢王译民谢宝娟朱芳芳李瑞婷杨炯高亚东武汉大学中南医院武汉430071

目的:观察钙池操纵性钙通道抑制剂SKF96365对小鼠慢性哮喘模型气道重塑和气道高反应性的影响。方法:用鸡卵清白蛋白(OVA)致敏和激发小鼠,建立慢性哮喘模型,33只雌性BALB/c小鼠随机分为3组:对照组、哮喘组、SKF96365组,每组11只,其中SKF9... 详细信息

目的:观察钙池操纵性钙通道抑制剂SKF96365对小鼠慢性哮喘模型气道重塑和气道高反应性的影响。方法:用鸡卵清白蛋白(OVA)致敏和激发小鼠,建立慢性哮喘模型,33只雌性BALB/c小鼠随机分为3组:对照组、哮喘组、SKF96365组,每组11只,其中SKF96365组于每次激发前30 min给予SKF96365(10mg/kg)干预。哮喘组和SKF96365组于第0、7、14 d腹腔注射(i.p)200μL致敏液(含OVA粉剂20μg、氢氧化铝凝胶2 mg);自第21天起,腹腔注射1%戊巴比妥钠(70mg戊巴比妥钠/kg小鼠体重)麻醉小鼠后,OVA(40μg)滴鼻(i.n),连续6周,每周3次,共18次。对照组则在相同时间给予相应剂量的生理盐水腹腔注射和滴鼻。最后一次激发后24 h,各组分别随机取5只小鼠用于检测组织病理学变化,另6只小鼠采用Buxco小动物肺功能仪检测气道高反应性。其中组织病理学检测计算杯状细胞(过碘酸希夫染色阳性,PAS+)、胶原细胞(Masson阳性)和平滑肌细胞(α-SMA阳性)阳染面积/支气管基底膜周长值来评估小鼠气道重塑;观察给予不同浓度乙酰甲胆碱雾化时的气道阻力(resistance index,RI)最大值,评估小鼠气道高反应性。结果:对照组未见PAS阳性染色区域,哮喘组和SKF96365组杯状细胞增生高于对照组(7.29±2.04,4.49±1.70 vs 0.00±0.00,均P0.05),当25 mg/m L>Mch≥12.25 mg/m L时,哮喘组小鼠气道阻力明显大于对照组小鼠(P性哮喘小鼠气道重塑和气道高反应性指标均有改善,提示SKF96365可能对哮喘气道重塑和气道高反应性具有抑制作用。

关键词：哮喘气道重塑气道高反应性钙池操纵性钙通道 SKF96365

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钙池操纵性钙通道与细胞增殖关系的研究进展

医学综述 2012年第14期18卷 2162-2164页

作者：庞春秀林德馨福建医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系福州350004

Ca2+是维持细胞正常生理功能的重要离子,参与细胞信息传递并调控一系列生命过程。钙池操纵性钙通道(SOCC)是细胞膜钙通道的一种。许多细胞内Ca2+主要通过SOCC机制影响正常细胞和肿瘤细胞的生长增殖。不同类型的细胞,SOCC通道相关蛋白的... 详细信息

Ca2+是维持细胞正常生理功能的重要离子,参与细胞信息传递并调控一系列生命过程。钙池操纵性钙通道(SOCC)是细胞膜钙通道的一种。许多细胞内Ca2+主要通过SOCC机制影响正常细胞和肿瘤细胞的生长增殖。不同类型的细胞,SOCC通道相关蛋白的表达量及其相互作用存在差异,从而影响细胞内Ca2+浓度,造成细胞的增殖、凋亡和迁移等生物学功能的改变。

关键词：钙池操纵性钙通道细胞增殖肿瘤

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钙池操纵性钙通道在心血管疾病中的研究进展

世界最新医学信息文摘 2018年第43期18卷 109-111页

作者：金鹏帅周萍赵贝大理大学基础医学院

钙池操纵性钙通道(SOCC)参与细胞的Ca2+内流过程,其中STIM和Orai1是组成SOCC的两种主要蛋白质。但它们的生理和病理生理过程并不完全清楚,在某些心血管疾病中它们所起的作用还处在初始研究阶段。本文就近年来对SOCC的分子机制的研究,相... 详细信息

钙池操纵性钙通道(SOCC)参与细胞的Ca2+内流过程,其中STIM和Orai1是组成SOCC的两种主要蛋白质。但它们的生理和病理生理过程并不完全清楚,在某些心血管疾病中它们所起的作用还处在初始研究阶段。本文就近年来对SOCC的分子机制的研究,相关蛋白分子STIM和Orai1的功能及它们与心血管疾病的关系作一综述,更加全面的概括SOCC及其调节分子在心血管疾病发生发展中的作用。

关键词：钙离子基质相互作用分子1 Orai1 心血管疾病钙池操纵性钙通道

动脉平滑肌细胞钙池操纵性钙通道分子对细胞自噬的调节

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动脉平滑肌细胞钙池操纵性钙通道分子对细胞自噬的调节

作者：陈富华福建医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨在大鼠动脉平滑肌细胞(Aortic smooth muscle cells,A7R5)中钙池操纵性钙通道(Store-operated Calcium Channel,SOCC)对细胞自噬的影响,为肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)发病机制的研究及治疗提供新思路和新靶点。方法:在293T细胞中包装含有STIM1、Orai1基因的慢病毒,将获得的慢病毒LV-STIM1、LV-Orai1感染大鼠A7R5细胞,Western-Blot检测感染前后STIM1、Orai1蛋白表达量。利用钙荧光测定大鼠A7R5细胞钙池操纵性Ca2+内流。Western-Blot检测感染后自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的蛋白表达量。慢病毒感染A7R5后雷帕霉素处理24h,巴佛洛霉素处理24h,饥饿处理6h,Western-Blot检测处理后各组自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的蛋白表达量。CCK-8检测过表达STIM1或/和Orai1对大鼠A7R5增殖的影响,以及过表达两种基因对顺铂诱导的细胞死亡的影响。结果:重组载体pLV-STIM1、pLV-Orai1经双酶切鉴定正确。将含有pLV-STIM1、pLV-Orai1载体的慢病毒感染大鼠A7R5,与正常组相比,Western-Blot检测感染后STIM1、Orai1蛋白表达量明显上升。CPA诱导的大鼠A7R5胞浆游离Ca2+浓度(intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i)升高幅度显著,说明过表达STIM1、Orai1蛋白增加了A7R5细胞的SOCE。Western-Blot检测感染前后及雷帕霉素和巴佛洛霉素处理感染前后自噬相关蛋白LC3、p62、Beclin-1蛋白表达量明显下降,说明自噬水平降低。CCK-8检测后发现过表达STIM1或(和)Orai1可显著提高大鼠A7R5的增殖能力。此外,过表达STIM1或(和)Orai1对顺铂诱导的A7R5细胞死亡有明显的拮抗作用。结论:钙池操纵性钙通道可引起大鼠A7R5胞浆Ca2+浓度升高从而使细胞自噬水平降低,可能与肺动脉高压发病机制相关。

关键词：肺动脉高压钙池操纵性钙通道细胞自噬

大鼠肺动脉平滑肌细胞中钾通道和钙通道的电生理特征以及在肺高压中的变化

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大鼠肺动脉平滑肌细胞中钾通道和钙通道的电生理特征以及在肺高压...

作者：张双双福建医科大学

学位级别：硕士

肺高压(Pulmonary hypertension,PH)是指由异源性疾病和多种发病机制引起的以肺血管收缩、重构、右心室肥厚以及肺动脉压力持续升高为主要特征的临床综合征。如果不及时治疗,PH会因引起右心功能不全,容量负荷过重而死亡。慢性低氧(Chron... 详细信息

肺高压(Pulmonary hypertension,PH)是指由异源性疾病和多种发病机制引起的以肺血管收缩、重构、右心室肥厚以及肺动脉压力持续升高为主要特征的临床综合征。如果不及时治疗,PH会因引起右心功能不全,容量负荷过重而死亡。慢性低氧(Chronic hypoxia,CH)和野百合碱(Monocrotaline,MCT)诱导的PH主要通过胶原纤维暴露,肺动脉血栓等一系列病理改变形成,如平滑肌细胞增殖。目前研究表明,胞浆内Ca2+水平的增加在PH的形成、血管重构及右心肥大等病理生理学过程中起重要作用。在肺血管中,CH和MCT诱导的PH能够抑制电压依赖性钾通道的功能,减小K+外流,导致细胞膜去极化,并且能激活Ca2+通道,引起Ca2+内流,促进肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)收缩。钾通道广泛存在于PASMCs中,参与调节细胞增殖和凋亡,并对肺血管重构有重要影响。目前,心肌细胞和神经元Ca2+通道的研究已经相当深入,而平滑肌细胞Ca2+通道的研究还很少。目的:通过观察CH和MCT诱导的PH大鼠PASMCs的电压依赖性钾电流(voltage-dependent potassium currents,IKV)、电压依赖性钙通道(VDCC)电流(IVDCC)、钙池操纵性钙通道(SOCC)电流(ISOCC)、受体操纵性钙通道(ROCC)电流(IROCC)的变化,阐明钙通道的特征以及在肺高压发病中的作用。方法:SD大鼠饲养箱氧分压为9.5%0.5%,建立CH诱导的慢性肺动PH大鼠模型。以2%MCT按50 mg/kg剂量一次性腹腔注射,建立MCT诱导的慢性PH大鼠模型,测定以下指标:(1)右心室收缩压(RVSP);(2)右心重量指数(RVMI)=(右心室重量(RV)/左心室重量(LV)+室间隔重量)(S)*100%。随后:(3)分离肺动脉,酶解法培养原代PASMCs,培养184小时后采用免疫组织化学法鉴定;(4)采用全细胞膜片钳技术分别记录PASMCs的IKV、IVDCC、ISOCC、IROCC,并观察不同激动剂和抑制剂对PASMCs的不同通道电流的影响,以及在PH中的变化。结果:与正常对照组(CON组)相比:(1)CH和MCT组的RVSP、RVMI均明显增高(P性钾通道的特异性抑制剂TEA阻断(P性钾电流密度明显减小(P性激动剂CPA能够激活ISOCC(P性激动剂OAG激活IROCC(P性抑制剂La3+减小CPA激活ISOCC(P性抑制剂La3+减小OAG激活IROCC(P性钾通道的开放被抑制,电流减小;(2)MCT诱导的PH模型大鼠PASMCs的VDCC开放增加,电流增大;(3)CH诱导的PH模型大鼠PASMCs的ROCC和SOCC开放增加,电流增大。因此,明确PASMCs钙通道电流变化对揭示PH的发病机制具有重要意义,并为开发治疗PH,针对特定亚型的高选择性离子通道活性的药物提供理论依据。

关键词：肺高压电压依赖性钙通道钙池操纵性钙通道受体依赖性钙通道钾通道

钙池操纵性钙内流在慢性缺氧致肺动脉平滑肌细胞内钙浓度升高中的作用及机制

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中华内科杂志 2016年第9期55卷 705-709页

作者：彭公永徐娟刘榕敏洪玮何新明林云恩广州医科大学附属第一医院广州呼吸疾病研究所呼吸疾病国家重点实验室 510120

目的探讨钙池操纵性钙内流（SOCE）在慢性缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）细胞内Ca2浓度（[Ca2＋]i）改变和细胞增殖中的作用及机制.方法原代培养大鼠PASMC,分为常氧组（21％O2）和缺氧组（4％O2）,活细胞计数试剂盒-8（CCK-8）... 详细信息

目的探讨钙池操纵性钙内流（SOCE）在慢性缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）细胞内Ca2浓度（[Ca2＋]i）改变和细胞增殖中的作用及机制.方法原代培养大鼠PASMC,分为常氧组（21％O2）和缺氧组（4％O2）,活细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测PASMC增殖,细胞内钙浓度检测系统检测[Ca2＋]i和SOCE,并观察钙池操纵性钙通道（SOCC）拮抗剂SKF96365和氯化镍对缺氧组PASMC SOCE的影响.结果缺氧24 h、36 h、48 h、60 h,PASMC增殖和升高[Ca2＋]i的效应呈时间依赖性,缺氧60h促进PASMC增殖（吸光度值1.12 ±0.09比0.71 ±0.05;P ＜0.05）和[Ca2＋]i升高[（214.8±20.4）nmol/L比（115.2±13.2） nmol/L;P＜ 0.05]的作用最明显.含硝苯地平（5 μmol/L）的无钙Krebs液孵育PASMC,环匹阿尼酸（CPA,10 μmol/L）导致PASMC[Ca2＋]i小幅升高,△[Ca2＋]i峰值为（113.3±49.3）nmol/L,慢性缺氧（4％O2,60 h）使PASMC[Ca2＋]i升高幅度增加,△[Ca2＋]i峰值达（193.2±22.7）nmol/L（P＜0.05）;恢复PASMC外Ca2＋后,CPA使PASMC[Ca2＋]i显著升高,△[Ca2＋]i峰值达（328.0±56.7）nmol/L,慢性缺氧导致CPA诱导的PASMC[Ca2＋]i升高更显著,A[Ca2＋]i峰值高达（526.0±33.7） nmol/L（P＜0.05）;SKF96365（50 μmol/L）和氯化镍（500 μmol/L）均能抑制慢性缺氧条件下CPA诱导的PASMC[Ca2＋]i升高,△[Ca2＋]i从（526.0±33.7）nmol/L分别降至（170.4±26.4） nmol/L和（177.4±45.9） nmol/L（P值均＜0.05）.结论慢性缺氧促进大鼠PASMC肌浆网中Ca2＋释放,并增强SOCC活性,使经由SOCC内流的SOCE升高,从而导致PASMC的[Ca2＋]i升高,进而促进大鼠PASMC增殖.

关键词：钙池操纵性钙通道钙池操纵性钙内流肌细胞,平滑肌,肺动脉细胞增殖缺氧

急性缺氧对环匹阿尼酸诱导的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高的影响

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中国循环杂志 2015年第8期30卷 800-804页

作者：彭公永胡国平赵祝香胡锦兴邹义敏彭芳广州医科大学附属第一医院广州呼吸疾病研究所呼吸疾病国家重点实验室广东省广州市510120

目的：研究急性缺氧对Ca2＋-ATPase抑制剂——环匹阿尼酸（CPA）诱导的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞（PVSMC）内钙浓度（[Ca2＋]i）升高的影响及机制。方法：选用6只雄性SD大鼠（体重200~250 g）,培养大鼠PVSMC,运用荧光显微镜和细胞内钙... 详细信息

目的：研究急性缺氧对Ca2＋-ATPase抑制剂——环匹阿尼酸（CPA）诱导的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞（PVSMC）内钙浓度（[Ca2＋]i）升高的影响及机制。方法：选用6只雄性SD大鼠（体重200~250 g）,培养大鼠PVSMC,运用荧光显微镜和细胞内钙浓度检测系统观测CPA及急性缺氧（4%O2）对PVSMC的[Ca2＋]i影响及钙池操纵性钙通道（SOCC）阻断剂氯化镍（Ni Cl2）和SKF96365的干预作用。结果：含5μmol/L硝苯地平（电压依赖钙通道阻断剂）的无钙Krebs溶液孵育PVSMC,10μmol/L CPA使PVSMC的[Ca2＋]i小幅度升高,急性缺氧能使[Ca2＋]i升高幅度增加;恢复细胞外Ca2＋至2.5 mmol/L后,10μmol/L CPA使[Ca2＋]i显著升高,急性缺氧可导致CPA诱导的[Ca2＋]i升高显著增强;SOCC阻断剂Ni Cl2（500μmol/L）和SKF96365（50μmol/L）均能明显抑制急性缺氧条件下CPA诱导的[Ca2＋]i升高,但对高钾（60 mmol/L KCl）Krebs溶液引起的[Ca2＋]i反应无影响。结论：急性缺氧能够使CPA诱导的大鼠远端PVSMC的[Ca2＋]i升高增强,[Ca2＋]i升高可被SOCC阻断剂阻断,提示急性缺氧能够增强SOCC活性,使细胞外Ca2＋通过SOCC内流增强,从而导致大鼠远端PVSMC的[Ca2＋]i升高。

关键词：急性缺氧环匹阿尼酸肺静脉平滑肌细胞细胞内Ca2+浓度钙池操纵性钙通道

小鼠远端肺动脉平滑肌细胞的原代培养方法及其功能学特性鉴定

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中华结核和呼吸杂志 2017年第2期40卷 81-85页

作者：李美婵陈豫钦张晨婷江倩卢文菊王健呼吸疾病国家重点实验室广州呼吸疾病研究所广州医科大学附属第一医院 510120

目的建立小鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的体外分离及原代培养方法，并鉴定其功能学特性。方法采用体视显微镜下分离纯化小鼠远端肺动脉平滑肌组织，并采用复合酶联合消化法消化后进行体外培养；倒置显微镜下观察小鼠原代远端PASMC... 详细信息

目的建立小鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的体外分离及原代培养方法，并鉴定其功能学特性。方法采用体视显微镜下分离纯化小鼠远端肺动脉平滑肌组织，并采用复合酶联合消化法消化后进行体外培养；倒置显微镜下观察小鼠原代远端PASMCs的生长特点；免疫荧光染色法对细胞进行鉴定；荧光显微镜下观察以Fura－2－AM荧光探针示踪的钙离子，检测细胞高钾反应及钙池操纵性钙内流反应，评价细胞活力。结果原代小鼠远端PASMCs分离培养6 d时细胞生长融合度达80%，生长状态较好，呈典型的谷－峰状形态；细胞α－肌动蛋白（α－SMA）染色阳性率为95%以上。利用含钙高钾Krebs液（钾离子浓度为60 mmol/L）灌流原代小鼠远端PASMCs，1 min后95%以上PASMCs细胞内钙离子浓度迅速上升，细胞内钙离子浓度（Δ[Ca2＋]i）变化值〉50，证明原代小鼠远端PASMCs中电压依赖性钙通道（VDCC）具有良好的功能；利用含钙Krebs液灌流5 min、无钙环匹阿尼酸和Nif Krebs液灌流10 min、以含钙环匹阿尼酸和Nif Krebs液灌流10 min及含钙Krebs液灌流10 min检测原代小鼠远端PASMCs中基础钙及钙池操纵性钙内流（SOCE），结果显示原代小鼠远端PASMCs对灌流液反应良好，钙离子浓度出现双峰变化，表明细胞中钙池操纵性钙通道（SOCC）功能优良。结论本实验通过复合酶消化法成功建立稳定可靠的原代小鼠肺动脉平滑肌体外培养方法，可获得纯度较高，功能良好的PASMCs，为肺血管疾病的研究提供了良好的细胞工具。

关键词：肌细胞,平滑肌原代培养电压依赖性钙通道钙池操纵性钙通道

环匹阿尼酸对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度的影响

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广东医学 2012年第23期33卷 3511-3514页

作者：彭公永蒋永亮胡国平周玉民胡锦兴赵祝香邹威凤广州医学院笫一附属医院广州呼吸疾病研究所呼吸疾病国家重点实验室广州510120

目的研究环匹阿尼酸(CPA)对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞(PVSMC)细胞内钙浓度([Ca2+]i)的影响及可能机制。方法原代培养大鼠远端PVSMC,并通过形态学和免疫荧光染色鉴定,利用荧光显微镜和InCyte细胞内钙浓度检测系统观测高钾(60 mmol/L KCl... 详细信息

目的研究环匹阿尼酸(CPA)对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞(PVSMC)细胞内钙浓度([Ca2+]i)的影响及可能机制。方法原代培养大鼠远端PVSMC,并通过形态学和免疫荧光染色鉴定,利用荧光显微镜和InCyte细胞内钙浓度检测系统观测高钾(60 mmol/L KCl)溶液及CPA对PVSMC的[Ca2+]i影响。结果原代培养的PVSMC表现出典型血管平滑肌细胞生长特征,并对平滑肌α-actin免疫荧光染色呈阳性反应;高钾溶液使PVSMC的[Ca2+]i显著升高,5μmol/L硝苯地平能完全阻断PVSMC的[Ca2+]i对高钾溶液的反应;10μmol/LCPA能使含5μmol/L硝苯地平的无钙Krebs溶液孵育的PVSMC的[Ca2+]i短暂小幅升高,恢复细胞外Ca2+至2.5 mmol/L后,10μmol/L CPA能使含5μmol/L硝苯地平的Krebs溶液孵育的PVSMC的[Ca2+]i迅速升高。结论 CPA能够使大鼠远端PVSMC的[Ca2+]i升高,其机制可能与Ca2+从肌浆网释放,并诱发细胞外Ca2+通过钙池操纵性钙通道(SOCC)内流有关。

关键词：环匹阿尼酸细胞内Ca2+浓度肺静脉平滑肌细胞大鼠钙池操纵性钙通道