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金黄色葡萄球菌肠毒素c2的制备研究

金黄色葡萄球菌肠毒素C2的制备研究

作者：应跃斌浙江大学

学位级别：硕士

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)是一类由Staphylococcus aureus(***)产生的外毒素,属于典型的超抗原(Superantigen,Sag),在极低的浓度下即可非特异地大量活化T细胞,从而达到增强免疫系统及杀伤肿瘤的效果。目... 详细信息

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)是一类由Staphylococcus aureus(***)产生的外毒素,属于典型的超抗原(Superantigen,Sag),在极低的浓度下即可非特异地大量活化T细胞,从而达到增强免疫系统及杀伤肿瘤的效果。目前已发现的SEs约有20余种,包括:SEA～SEE、SEG～SEQ及TSST-1等,其中SEc又分为SEc1～SEc3三个氨基酸序列同源性大于96%的亚型。SEs具有良好的抗肿瘤理论及实践基础,但是单纯以SAg理论开发的抗肿瘤药物仍未上市。我国企业自主开发了以***发酵上清液为主要成分的金葡液制剂,已应用于多种肿瘤及其它疾病的辅助治疗。沈阳协和集团在其金葡液制剂高聚生中检出微量SEc,并将SAg抗肿瘤理论应用于该产品。由于SEc在金葡液中含量甚微,与大量的菌体代谢产物及培养基成分共存,并且在临床使用中,金葡液还表现出了一些SAg理论难以解释的疗效,故难以判定SEc在金葡液抗肿瘤治疗中的关键作用。为了获得纯SEc蛋白,研究其抗肿瘤效果,本课题选择SEc三个亚型之一的SEc2作为研究对象,从天然产SEc2的***发酵上清液出发,通过超滤浓缩、硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析纯化获得天然SEc2(native SEc2,nSEc2)。通过这一方法得到的nSEc2纯度达到90%左右,但蛋白总量较少。由于本实验室在通过基因工程手段大量表达重组蛋白方面的技术已经比较成熟,根据SEc2来源于原核细胞,从天然产SEc2的***中获得sec2基因,克隆至***大量表达重组SEc2(recombinant SEc2,rSEc2),通过阴离子交换层析和分子筛层析两步纯化得到纯度高于90%的rSEc2,蛋白得率高于nSEc2,并且该重组蛋白仅在N端比nSEc2多一个蛋氨酸(Met)。通过添加His-Tag实现亲和层析法纯化是目前常用的重组蛋白表达、纯化

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素c2 超抗原克隆表达纯化阴离子交换层析分子筛层析亲和层析 MTT法抗肿瘤活性蛋白酶活性

金黄色葡萄球菌肠毒素c2突变体构建及其生物活性研究

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金黄色葡萄球菌肠毒素C2突变体构建及其生物活性研究

作者：曹琰辽宁大学

学位级别：硕士

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)是一类具有高度生物学活性的蛋白质、能活化T细胞的超抗原。与普通抗原不同,超抗原无须经抗原提呈细胞(Antigen presenting cell, APc)加工处理,可以完整的蛋白分子形式直接与... 详细信息

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)是一类具有高度生物学活性的蛋白质、能活化T细胞的超抗原。与普通抗原不同,超抗原无须经抗原提呈细胞(Antigen presenting cell, APc)加工处理,可以完整的蛋白分子形式直接与抗原提呈细胞膜上的MHc-II(Major histocompatibility complex class II molecules, MHc-II)类分子及T细胞受体Vβ区(Variable pacts of the T cells receptor, TcR V?)特异性结合,刺激T细胞增殖,产生大量有生物学活性的细胞因子和药性效应,引发超级抗原依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Superantigen dependent cell-mediated cytotoxicity, SDcc)和其它免疫效应。利用SEs的这一特点,沈阳协和集团开发出以金黄色葡萄球菌肠毒素c2(SEc2)为主要成分的新型抗肿瘤生物制剂——“高聚生”,临床用于治疗肺癌、食道癌、卵巢癌、晚期肝癌、大肠癌、血癌、膀胱癌等恶性肿瘤,效果显著。但作为潜在的肠胃毒素,SEc2可引起食物中毒,引发腹绞痛和严重腹泻,这严重影响和限制了其在临床的广泛应用。肠毒素结构与其致病性及致病能力关系密切,肠毒素所引发的催吐效应和T细胞诱导效应无关,而与胱氨酸环(cys93, cys110)及His118有关。为此,本研究利用基因定点突变技术,选择性替换SEc2中110位cys和118位His,获得了相应的突变基因,并在大肠杆菌中实现高效表达。体外PBMc(Peripheral blood mononuclear cell, PBMc)增殖和抑瘤实验被用于分析突变体蛋白的超抗原活性和抑瘤活性。本研究结果如下:1)利用PcR定点突变技术,SEc2中110位cys成功的被Ala和Ser替换,118位的His被Tyr替换。带有突变基因的表达质粒在E. coli BL21 (DE3)中经IPTG诱导,实现高效表达。SDS-PAGE电泳结果表明,经Ni-NTA亲和层析柱和Sephadex G-75纯化获得的突变体蛋白呈单一条带;2) PBMc增殖研究表明,所有突变体蛋白均能有效刺激PBMc增殖,与SEc2无明显差异,在200 ng/ml时,增殖能力最强。3)体外抑瘤实验表明,所有突变体都在不同程度上抑制了大肠癌细胞cX-1的生长,其中SEc2(c93S, c110S)抑瘤效果最为明显,在2 ng/ml和500 ng/ml之间,抑瘤效果均略高于SEc2。综上所述,本研究成功的利用基因定点突变技术,替换了SEc2中与催吐有关的氨基酸,获得了超抗原活性和抑瘤活性基本保持不变的SEc2突变体,从而为开发无毒、无副作用的新型抗肿瘤生物制剂奠定了工作基础。

关键词：超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素c2 点突变 PBMc增殖体外抑瘤

增强型金黄色葡萄球菌肠毒素c2突变体及其超抗原活性

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生物工程学报 2013年第6期29卷 803-813页

作者：张国俊徐明恺孙健李洪义杨宏丽张惠文张成刚中国科学院大学沈阳应用生态研究所辽宁沈阳110016 中国科学院大学北京100049 沈阳协合生物制药股份有限公司辽宁沈阳110179

金黄色葡萄球菌肠毒素c2(Staphylococcal enterotoxin c2,SEc2)作为一种超级抗原蛋白,极微量即可有效激活机体免疫系统,这一特性可应用于对肿瘤和感染性疾病的辅助治疗。为了增强SEc2的超抗原活性,应用over-lap PcR方法将SEc2中的102～... 详细信息

金黄色葡萄球菌肠毒素c2(Staphylococcal enterotoxin c2,SEc2)作为一种超级抗原蛋白,极微量即可有效激活机体免疫系统,这一特性可应用于对肿瘤和感染性疾病的辅助治疗。为了增强SEc2的超抗原活性,应用over-lap PcR方法将SEc2中的102～106位GKVTG氨基酸残基分别突变为WWH、WWT和WWP,获得3种突变体ST-1、ST-2和ST-3。三种突变体刺激小鼠淋巴细胞增殖活性和肿瘤细胞生长抑制活性与野生型SEc2相比均有显著提高。ST-1和ST-3的致热活性与野生型SEc2相当,而ST-2的致热活性明显高于野生型SEc2。此外,三种突变体体外刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平也显著提高,这可能是导致突变体具有较高肿瘤细胞生长抑制活性的原因。进一步实验发现,三种突变体刺激下,小鼠脾淋巴细胞mVβ8.2基因的转录水平较野生型SEc2显著增加,暗示突变体对TcR mVβ8.2分子亲和力的提高,可能是其超抗原活性增强的主要原因。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素c2 超抗原活性 T细胞受体(T cell receptor,TcR) 致热活性细胞因子

金黄色葡萄球菌肠毒素c2中20位氨基酸对超抗原活性的影响

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金黄色葡萄球菌肠毒素C2中20位氨基酸对超抗原活性的影响

Zn^2＋及其谷氨酸结合位点突变对金黄色葡萄球菌肠毒素 c2超抗原活性的影响

第五届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会

作者：张国俊徐明恺姚崧源张惠文张成刚中国科学院大学沈阳应用生态研究所中国科学院大学

金黄色葡萄球菌肠毒素c2(Staphylococcal enterotoxin c2,SEc2)作为一种超级抗原蛋白,极微量即可有效激活机体免疫系统,这一特性可应用于对肿瘤和感染性疾病的辅助治疗。为了增强SEc2的超抗原活性,应用定点突变方法将SEc2中的20位T氨基... 详细信息

金黄色葡萄球菌肠毒素c2(Staphylococcal enterotoxin c2,SEc2)作为一种超级抗原蛋白,极微量即可有效激活机体免疫系统,这一特性可应用于对肿瘤和感染性疾病的辅助治疗。为了增强SEc2的超抗原活性,应用定点突变方法将SEc2中的20位T氨基酸残基突变为L,获得突变体ST-5。突变体刺激小鼠淋巴细胞增殖活性和肿瘤细胞生长抑制活性与野生型SEc2相比均有显著提高。此外,突变体体外刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平也显著提高,这可能是导致突变体具有较高肿瘤细胞生长抑制活性的原因。进一步实验发现,突变体刺激下,小鼠脾淋巴细胞m Vβ8.2和8.3基因的转录水平较野生型SEc2显著增加,暗示突变体对TcR m Vβ8.2和8.3分子亲和力的提高,可能是其超抗原活性增强的主要原因。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素c2 超抗原活性 T细胞受体(T cell receptor TcR) 细胞因子

来源： cnki会议评论

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中华微生物学和免疫学杂志 2014年第6期34卷 442-446页

作者：刘彦礼牛荣成徐明恺李旭孙健张惠文新乡医学院生命科学技术学院 453003 中国科学院沈阳应用生态研究所 110016

目的：研究金黄色葡萄球菌（金葡菌）肠毒素c2（SEc2）中与Zn^2＋结合相关的谷氨酸残基突变及Zn^2＋自身对其超抗原活性的影响。方法应用定点突变技术将SEc2中与Zn^2＋结合相关的谷氨酸残基突变成丙氨酸残基，分离纯化后获得突变蛋白rS... 详细信息

目的：研究金黄色葡萄球菌（金葡菌）肠毒素c2（SEc2）中与Zn^2＋结合相关的谷氨酸残基突变及Zn^2＋自身对其超抗原活性的影响。方法应用定点突变技术将SEc2中与Zn^2＋结合相关的谷氨酸残基突变成丙氨酸残基，分离纯化后获得突变蛋白rSEc2（E71A）、rSEc2（E80A）及rSEc2（E71A/E80A）；突变蛋白的超抗原活性及Zn^2＋对SEc2超抗原活性的影响通过MTT法检测其刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖来验证，而结构稳定性通过对胃蛋白酶及胰蛋白酶的抵抗能力来检测。结果蛋白酶酶切结果与脾淋巴细胞增殖实验结果表明参与第2个Zn^2＋结合的71位及80位谷氨酸残基突变对SEc2的酶解稳定性及超抗原活性没有显著影响；但微量Zn^2＋（10μmol/L）却能显著增强rSEc2的超抗原活性，并且在EDTA存在下，仅有Zn^2＋在一定浓度下才可完全恢复其超抗原活性。结论SEc2分子中的Zn^2＋结合位点的突变对其自身结构稳定性和超抗原活性无显著影响，但SEc2超抗原活性发挥过程中Zn^2＋可能通过其他途径间接影响其超抗原活性。

关键词： Zn^2+ 金黄色葡萄球菌肠毒素c2 超抗原 T淋巴细胞

金黄色葡萄球菌肠毒素c2His118定点突变研究

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金黄色葡萄球菌肠毒素C2His118定点突变研究

作者：杨浩民贵州大学

学位级别：硕士

超抗原(Superantigen,SAg)是一类具有多种免疫活性的蛋白分子,能大量激活T细胞。与普通抗原不同,超抗原无需抗原提呈细胞的加工处理,以完整蛋白形式结合于MHcⅡ(Major histocompatibility complex classⅡmolecules,MHcⅡ)类分子结合槽... 详细信息

超抗原(Superantigen,SAg)是一类具有多种免疫活性的蛋白分子,能大量激活T细胞。与普通抗原不同,超抗原无需抗原提呈细胞的加工处理,以完整蛋白形式结合于MHcⅡ(Major histocompatibility complex classⅡmolecules,MHcⅡ)类分子结合槽的外侧及T细胞表面TcR Vβ(Variable pacts ofthe T cellreceptor,TcR Vβ)区。微量超抗原即可产生大量有生物学活性的细胞因子和药性效应,引发超级抗原依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Superantigen dependentcell-mediated cytotoxicity,SDcc)和其它免疫效应,从而可在体内抑制肿瘤细胞生长。Staphylococcus enterotoxin c2(SEc2)作为由金黄色葡萄球菌产生的超抗原,在临床已被用于肺癌、食道癌、卵巢癌、晚期肝癌、大肠癌、血癌、膀胱癌等恶性肿瘤的治疗,效果极为显著。但作为潜在的肠胃毒素,SEc2会引起呕吐、腹泻等症状,严重限制了其在肿瘤治疗中的应用。肠毒素分子结构与其致病性、致病能力关系密切,肠毒素所引发的催吐效应和T细胞诱导效应无关,而与His118有关。本研究利用PcR介导的定点突变技术,对sec2基因中的His118密码子实行定点突变,获得突变体蛋白。通过刺激鼠脾淋巴细胞增殖和胰酶稳定性研究,分析突变体蛋白的超抗原活性及胰酶稳定性。通过对人大肠癌细胞cX-1抑瘤研究,确认突变体抑瘤效果。本研究结果如下:应用MutanBEST Kit试剂盒,以pET-28a-SEc2为模板进行PcR扩增,获得SEc2突变体表达质粒:pET-28aoSEc2(H118Y)。SEc2突变基因在大肠杆菌中经IPTG诱导,实现高效表达。经Ni-NTA亲和层析柱和Sephadex G-75纯化,获得高纯度的突变体蛋白。在胰蛋白酶与突变体蛋白的质量比在1:200的条件下,观察突变体蛋白胰酶稳定性。SDS-PAGE结果表明,突变体蛋白SEc2(H118Y)胰酶稳定性较好,略低于SEc2。鼠脾淋巴细胞增殖和体外抑瘤结果表明,突变体蛋白可有效刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,表明所获得突变体蛋白的超抗原活性没有因为118位His的定点突变而改变。此外,突变体蛋白可明显抑制人大肠癌细胞cx-1的生长,抑瘤效果与SEc2相似。

关键词：超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素c2 定点突变 PBMc增殖体外抑瘤

金黄色葡萄球菌肠毒素c_2对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的实验研究

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创伤外科杂志 2013年第5期15卷 444-448页

作者：董晨辉王子明杜全印王雨黄恺王爱民第三军医大学大坪医院野战外科研究所骨科中心关节四肢外科重庆400042

目的观察不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素c2(SEc2)对体外兔骨髓间充质干细胞(rBMScs)的诱导分化作用。方法以梯度密度离心法获得rBMScs并通过激光共聚焦对细胞进行形态学鉴定后传代培养,分别应用1、10、100、500μM SEc2处理细胞,检测各... 详细信息

目的观察不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素c2(SEc2)对体外兔骨髓间充质干细胞(rBMScs)的诱导分化作用。方法以梯度密度离心法获得rBMScs并通过激光共聚焦对细胞进行形态学鉴定后传代培养,分别应用1、10、100、500μM SEc2处理细胞,检测各组细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的增殖情况;逆转录-聚合酶链反应(RT-PcR)法检测骨桥蛋白和胶原蛋白的基因表达。结果 rBMScs在应用SEc2诱导时,随着浓度的增加,rBMScs的增殖逐渐被抑制,其中100μM SEc2共培养细胞增殖情况明显高于对照组(Pc2诱导rBMScs 16d后,成骨诱导检测茜素红染色可见矿化和钙沉积;同时进行RT-PcR检测,随着培养时间的延长,骨桥蛋白(Osteopontin)和胶原蛋白-1(collagen I)有明显上调趋势,差异均有统计学意义(Pc2能够使rBMScs成骨分化,分化的效果与肠毒素剂量及诱导时间相关。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素c2 骨髓间充质干细胞成骨分化

肠毒素c2第20和22位氨基酸对其超抗原活性的影响

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中国免疫学杂志 2014年第12期30卷 1596-1600页

作者：刘彦礼牛荣成徐明恺李旭苏振成张惠文新乡医学院生命科学技术学院新乡453003 中国科学院沈阳应用生态研究所沈阳110016

目的:揭示突变蛋白SEc2(T20L/G22E)超抗原活性较野生型SEc2显著增强的潜在机制。方法:WST-1法检测突变蛋白SEc2(T20L/G22E)在体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性,进一步应用流式细胞术和荧光定量PcR技术分别检测cD4+和cD8+T淋巴细胞增殖、... 详细信息

目的:揭示突变蛋白SEc2(T20L/G22E)超抗原活性较野生型SEc2显著增强的潜在机制。方法:WST-1法检测突变蛋白SEc2(T20L/G22E)在体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性,进一步应用流式细胞术和荧光定量PcR技术分别检测cD4+和cD8+T淋巴细胞增殖、特异性VβT淋巴细胞增殖以及相关细胞因子mRNA丰度变化。结果:与野生型SEc2相比,突变蛋白SEc2(T20L/G22E)能够在体外显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,但二者具有相似的特异性VβT淋巴细胞增殖谱,并且SEc2(T20L/G22E)能够较rSEc2激活更多携带有Vβ5.3、Vβ8.1及Vβ8.3的T淋巴细胞;进一步体内实验发现SEc2(T20L/G22E)能够较rSEc2激活更多外周血和脾脏中cD4+和cD8+T淋巴细胞增殖及相关细胞因子的表达。结论:突变蛋白SEc2(T20L/G22E)超抗原活性增强的机制可能是用亮氨酸和谷氨酸替代原来20和22位上的氨基酸后提高了SEc2(T20L/G22E)与特异性TcR-Vβ的亲和力,进一步激活更多的SEc2特异性T淋巴细胞,最终引起T淋巴细胞亚型的显著性增殖,同时诱导更多与抗肿瘤、增殖相关的细胞因子的表达。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素c2 超抗原 T淋巴细胞细胞因子

肠毒素c2中Met24对其超抗原活性无重要作用

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生物技术 2011年第4期21卷 67-70页

作者：王洪波李洪义孙健张惠文徐明恺中国科学院沈阳应用生态研究所辽宁沈阳110016 中国科学院研究生院北京100049 沈阳协合生物制药股份有限公司辽宁沈阳110179

目的:分析金黄色葡萄球菌肠毒素c2的T细胞受体结合区域α3结构中,第24位甲硫氨酸对其超抗原活性的影响作用。方法:应用定点突变技术对金黄色葡萄球菌肠毒素c2的Met24进行无意义突变,获得突变蛋白SEc2(M24A),对突变蛋白和野生型蛋白的体... 详细信息

目的:分析金黄色葡萄球菌肠毒素c2的T细胞受体结合区域α3结构中,第24位甲硫氨酸对其超抗原活性的影响作用。方法:应用定点突变技术对金黄色葡萄球菌肠毒素c2的Met24进行无意义突变,获得突变蛋白SEc2(M24A),对突变蛋白和野生型蛋白的体内、体外超抗原活性进行比较。结果:分别对野生型蛋白及突变蛋白的免疫刺激活性、肿瘤抑制活性、体内致热毒性进行了比较,发现突变蛋白的增值指数(PI)、抑瘤率、热源效应与野生型相比无显著差异(P>0.05),这表明对第24位甲硫氨酸的替换没有对金黄色葡萄球菌肠毒素c2的超抗原活性造成明显影响。结论:在金黄色葡萄球菌肠毒素c2的α3结构中,Met24并不是决定其超抗原活性的重要氨基酸残基。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素c2 定点突变 T细胞受体