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金黄色葡萄球菌核酸酶a在温控双表达载体中的表达及其活性分析

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生物学杂志 2018年第2期35卷 34-37页

作者：付立霞张磊李欣容韩先干高波张晓君魏文志江苏省人畜共患病学重点实验室扬州大学动物科学与技术学院扬州225009 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

菌蜕制备时,金黄色葡萄球菌核酸酶a(Staphylococcal nuclease A,SNA)在温控单表达系统中表达时,对宿主菌的灭活效率比其在双表达系统中与基因E共表达时的灭活效率高近一个数量级。为探究导致这种差异的可能机制,将SNA克隆至一温控双表... 详细信息

菌蜕制备时,金黄色葡萄球菌核酸酶a(Staphylococcal nuclease A,SNA)在温控单表达系统中表达时,对宿主菌的灭活效率比其在双表达系统中与基因E共表达时的灭活效率高近一个数量级。为探究导致这种差异的可能机制,将SNA克隆至一温控双表达载体进行诱导表达并对其活性进行综合分析。结果显示,胞内和胞外产物均具有核酸酶活性,分别在升温诱导30 min和90 min后被检出,对宿主菌的4 h灭活率为99.7%,宿主基因组亦被成功降解。这表明,SNA在温控双表达载体中的表达仍能如在单表达载体中一样有效灭活细菌,裂解基因E和SNA的共表达可能才是造成上述差异的主要原因。

关键词：金黄色葡萄球菌核酸酶a 菌蜕裂解基因E

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制备大肠杆菌菌蜕的方法比较

江苏农业学报 2020年第2期36卷 410-416页

作者：袁橙郭长明左伟勇郝福星左沁丹蔺辉星江苏农牧科技职业学院动物医学院江苏泰州225300 南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为进一步研究大肠杆菌菌蜕的制备技术,以pBV221、pCold IV和pETDuet1载体为基础构建了表达噬菌体E基因的溶菌质粒,并利用pETDuet1的2个多克隆位点构建了同时表达E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶a的双表达溶菌质粒。经检测,pBV221-E/DH5α组... 详细信息

为进一步研究大肠杆菌菌蜕的制备技术,以pBV221、pCold IV和pETDuet1载体为基础构建了表达噬菌体E基因的溶菌质粒,并利用pETDuet1的2个多克隆位点构建了同时表达E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶a的双表达溶菌质粒。经检测,pBV221-E/DH5α组和pCold-E/BL21组的裂解效率最高,但pCold-E/BL21组的裂解起始时间晚于其他几组。诱导剂的浓度对pETDuet1-E-SNA/BL21(DE3)的裂解效率有较大影响。电泳结果显示,随着E基因的表达,细菌DNA逸出膜外,同时金黄色葡萄球菌核酸酶a将DNA降解为250 bp以下的小片段。除pBV221-E/BL21组外,β-丙内酯可实现对其他试验组菌蜕的完全灭活。电镜观察发现,几组菌蜕在结构上并无明显差别。与对照菌相比,菌蜕结构完整,电子密度低且不均匀,细胞膜有不同程度的皱缩。

关键词：菌蜕大肠杆菌 E基因金黄色葡萄球菌核酸酶a 裂解效率

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利用温控双表达载体制备印第安纳沙门菌菌蜕

中国预防兽医学报 2021年第3期43卷 246-251,264页

作者：龚建森徐敬潇付立霞韩先干张笛董永毅徐步江苏省家禽科学研究所江苏扬州225125 扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 江苏省动物疫病预防控制中心江苏南京210036

为制备安全高效的印第安纳沙门菌菌蜕,本研究以温控质粒pTCV为载体,分别构建出只含噬菌体PhiX174裂解基因E的pTCK01质粒、同时含裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶a(SNA)的pTCK02质粒及对裂解基因E和SNA密码子优化后的p TCK03质粒,分别... 详细信息

为制备安全高效的印第安纳沙门菌菌蜕,本研究以温控质粒pTCV为载体,分别构建出只含噬菌体PhiX174裂解基因E的pTCK01质粒、同时含裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶a(SNA)的pTCK02质粒及对裂解基因E和SNA密码子优化后的p TCK03质粒,分别转化印第安纳沙门菌S1105后经42℃诱导表达,并对各重组菌开展溶菌动力学监测、重组菌的基因组电泳检测和菌蜕电镜观察。PCR鉴定结果表明,重组质粒pTCK01、pTCK02和pTCK03均正确构建。溶菌动力学显示,含质粒pTCK03的重组菌S1105(pTCK03/S1105)的OD600nm值在诱导后120 min达到最低,且低于重组菌p TCK01/S1105和重组菌pTCK02/S1105,之后一直稳定在最低水平;其溶菌率也显著高于pTCK01/S1105和p TCK02/S1105(p<0.05)。基因组电泳检测结果显示,pTCK03/S1105基因组在诱导1 h后即被降解且降解得最彻底。扫描和透射电镜观察结果显示,pTCK03/S1105菌蜕表面形态明显皱缩,胞质内容物完全释放。上述结果表明,通过优化裂解基因E和SNA密码子可提高印第安纳沙门菌菌蜕的裂解效率,并彻底降解了其遗传物质,本研究为印第安纳沙门菌菌蜕疫苗的研发提供新思路和参考。

关键词：菌蜕印第安纳沙门菌双表达载体裂解基因E 金黄色葡萄球菌核酸酶a

牛源大肠杆菌O14菌蜕的制备及其免疫原性的研究

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牛源大肠杆菌O14菌蜕的制备及其免疫原性的研究

作者：张伟吉林农业大学

学位级别：硕士

大肠杆菌(Escherichia coli),是一种重要的人畜共患病病原菌。该菌在环境中广泛存在,部分菌株具有较强的致病性,菌蜕(BGs)是革兰阴性菌被噬菌体PhiX174裂解基因E裂解后形成的完整细菌空壳,无细胞内容物。除可以作为疫苗外,还可作为佐剂... 详细信息

大肠杆菌(Escherichia coli),是一种重要的人畜共患病病原菌。该菌在环境中广泛存在,部分菌株具有较强的致病性,菌蜕(BGs)是革兰阴性菌被噬菌体PhiX174裂解基因E裂解后形成的完整细菌空壳,无细胞内容物。除可以作为疫苗外,还可作为佐剂、外源蛋白抗原、生物活性物质和DNA疫苗载体等多种功能。仅通过基因E裂解制备菌蜕,还可能具有病原岛或抗生素抗性基因水平转移等风险。因此,作为疫苗或疫苗载体的菌蜕应当更为安全。为了尽量消除裂解后细菌的活力并清除残留的遗传物质,本研究又将辅助致死基因SNA引入裂解表达系统中,并构建了新型温控表达质粒pBVE-CIP-SNA(pBVES),成功导入牛源大肠杆菌O14野生株,且进行反复多次溶菌动力学试验,质粒型大肠杆菌菌蜕裂解率高达99.65%,用透射电镜进行观察,与正常状态大肠相比菌蜕内容物外排彻底,形态及表面结构完整。为验证菌蜕免疫原性,研究设立菌蜕组、灭活组、灭活佐剂组为试验组,对照组为PBS组,通过测定不同免疫指标来比较四组的免疫原性。结果显示:随着免疫次数增加,试验组血清IgG含量明显高于对照组,小鼠淋巴细胞亚群试验结果表明菌蜕能刺激小鼠机体产生Th1型细胞免疫应答,而小鼠主要细胞因子检测结果表明菌蜕组的IFN-γ和IL-12分泌水平明显高于其他试验组和对照组,且试验组均高于对照组水平,但IL-4试验组的分泌水平与对照组差异不明显。攻毒保护结果显示,菌蜕组对小鼠机体保护率可达到70%。临床症状表明,在攻毒后,菌蜕组小鼠状态优于其他免疫组。综上所述,质粒型大肠杆菌菌蜕具有较好的免疫原性,研究结果为新型疫苗的研究提供依据,具有广阔的应用前景。

关键词：大肠杆菌菌蜕免疫原性裂解基因E 金黄色葡萄球菌核酸酶a

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重组双基因支气管败血波氏杆菌幽灵的研究

重组双基因支气管败血波氏杆菌幽灵的研究

作者：谢波南昌大学

学位级别：硕士

传统的灭活疫苗是预防动物疫病的重要手段之一。然而,由于灭活疫苗在制备过程中的抗原决定簇可能被物理或化学(福尔马林)处理而破坏或部分被破坏,导致保护效率低或能起到保护但动物是该病原菌的携带者;此外,由于疫苗是灭活的全细胞,存... 详细信息

传统的灭活疫苗是预防动物疫病的重要手段之一。然而,由于灭活疫苗在制备过程中的抗原决定簇可能被物理或化学(福尔马林)处理而破坏或部分被破坏,导致保护效率低或能起到保护但动物是该病原菌的携带者;此外,由于疫苗是灭活的全细胞,存在将耐药基因和毒素编码基因带入被接种动物的风险。因此,研究保留天然抗原结构并消除耐药性和致病性风险具有重要的理论和应用意义。我们采用基因工程手段,以猪的支气管败血波氏杆菌和大肠杆DH5α为研究对象,构建了含噬菌体PhiX174的裂解E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶a基因(SN)重组质粒,使金黄色葡萄球菌核酸酶a可在IPTG的诱导下表达,裂解蛋白E可在温控诱导下表达。将构建的质粒转入大肠杆DH5a和支气管败血波氏杆菌,从而试图去除细胞质和耐药基因以及水解DNA保留天然抗原。结果如下：1.为了提高细菌幽灵的安全水平,将含噬菌体PhiX174的裂解E基因盒和金黄色葡萄球菌核酸酶a基因一起插入质粒,构建了含氨苄青霉素抗性基因的质粒pGEX-4T-1-S-E和含卡那霉素抗性基因的融合表达质粒pET29a-S1-E、非融合表达质粒pET29a-S2-E,通过单酶切和琼脂糖电泳鉴定表明,质粒pGEX-4T-1-S-E为6822bp,融合表达质粒pET29a-S1-E为7211bp,非融合表达质粒pET29a-S2-E为7106bp,所构建的这三种质粒大小都与理论值相符合;对SN基因和含噬菌体phiX174的裂解E基因盒进行测序鉴定,SN基因所测得基因序列与GenBank中MRSA252菌株的SN基因完全相同,E盒所测得基因序列与理论序列完全相同;证明这三种质粒都构建成功。2.将重组质粒pGEX-4T-1-S-E转入大肠杆菌DH5α并诱导表达,检测菌体及上清液中所含的DNA,结果显示大部分DNA被降解成100bp左右;用CFU检测,大肠杆菌DH5α的裂解致死率最高达99.999%,成功地制备了大肠杆菌DH5α细菌幽灵。3.猪的支气管败血波氏杆菌的药敏实验,从药敏试纸的抑制圈大小结果表明,支气管败血波氏败血杆菌对氨苄青霉素,庆大霉素有耐药性,而对氯霉素,四环素,卡那霉素很敏感。因此选择含有抗卡那霉素的质粒在支气管败血波氏杆菌中表达。4.在大肠杆菌中表达成功的基础上,将含有抗卡那霉素的融合表达质粒pET29a-S1-E与非融合表达质粒pET29a-S2-E分别转入支气管败血波氏杆菌中并诱导表达,检测菌体及上清液中所含的DNA,结果显示大部分DNA被降解成100bp大小;用CFU检测,含质粒pET29a-S1-E的支气管败血波氏杆菌的裂解致死率最高达99.994%,含质粒pET29a-S2-E的支气管败血波氏杆菌的裂解致死率最高达99.993%,实现了支气管败血波氏杆菌的遗传灭活。在裂解致死率上,非融合质粒和融合质粒表达效果差别不大。

关键词：支气管败血波氏杆菌裂解E基因金黄色葡萄球菌核酸酶a

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App菌影温控双基因裂解系统的构建

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