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金黄色葡萄球菌核酸酶C末端去9肽对酶蛋白溶液构象的影响

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生物物理学报 2003年第1期19卷 7-12页

作者：徐立东童宇峰王金凤中国科学院生物物理所

通过多维异核核磁共振方法,结合运用荧光和圆二色等光谱方法,比较研究了V8菌株金黄色葡萄球菌核酸酶(含149个氨基酸残基),酶蛋白1～140片段(SNase140)以及在TMP(thymidine 5’-monophosphate)和Ca^(2+)存在下的SNase140的溶液构象状态... 详细信息

通过多维异核核磁共振方法,结合运用荧光和圆二色等光谱方法,比较研究了V8菌株金黄色葡萄球菌核酸酶(含149个氨基酸残基),酶蛋白1～140片段(SNase140)以及在TMP(thymidine 5’-monophosphate)和Ca^(2+)存在下的SNase140的溶液构象状态。探讨了酶蛋白C末端去9肽后对酶蛋白构象和活力的影响。研究指出,远离酶蛋白活性部位残基间相互作用的变化,将通过酶蛋白两个亚结构域之间所形成的氢键,影响酶蛋白活性部位的空间构象,从而影响酶蛋白的活力。

关键词：金黄色葡萄球菌核酸酶多维核磁共振 N端140片段

金黄色葡萄球菌核酸酶N-末端片段β亚结构域的折叠及动态特性

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金黄色葡萄球菌核酸酶N-末端片段β亚结构域的折叠及动态特性

用于单分子动力学实验的微流控混合器(英文)

第七届全国酶学学术讨论会

作者：刘东升冯银刚叶克穷单璐王金凤中国科学院生物物理研究所分子生物学研究中心生物大分子国家重点实验室

金黄色葡萄球菌核酸酶N末端110片段(SNase11O),包含残基1-110,处于去折叠态和折叠态之间的动态平衡中,且主要以去折叠态存在。G88W突变(G88W110),V66W突变(V66W110)和加入氧化三甲基胺(TMAO,TrimethylamineN-oxide),可以使SNase110片段折叠稳定成协同稳定的β桶结构。G88W和V66W突变主要通过增加β桶的折叠稳定性而TMAO主要通过增强蛋白主链与溶液的疏水相互作用来使蛋白质趋于折叠。

关键词：金黄色葡萄球菌核酸酶磁共振溶液结构主链运动性

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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物理化学学报 2011年第8期27卷 1990-1995页

作者：支泽勇刘鹏程黄岩谊赵新生北京大学化学与分子工程学院化学生物学系北京分子科学国家实验室分子动态与稳态结构国家重点实验室北京100871 北京大学工学院北京100871 北京大学生物动态光学成像中心北京100871

设计制作了用于单分子动力学实验的微流控混合器,该混合器用聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片和石英载玻片密封而成,具有低的荧光背景,广泛的生物相容性,结合激光共聚焦显微镜能够在非平衡态下进行单分子荧光探测.我们设计的压力控制系统和进... 详细信息

设计制作了用于单分子动力学实验的微流控混合器,该混合器用聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片和石英载玻片密封而成,具有低的荧光背景,广泛的生物相容性,结合激光共聚焦显微镜能够在非平衡态下进行单分子荧光探测.我们设计的压力控制系统和进样流路方便而稳定,保证了微流路中流形的长时间稳定,从而实现了样品流速和流量的精准控制.这些技术特点保证了单分子探测得到准确和高信噪比的结果.利用蛋白质的塌缩过程远快于混合过程的特点,采用荧光标记的金黄色葡萄球菌核酸酶作为指示物,分辨出蛋白质变性态的特征峰,并利用变性态的荧光共振能量传递效率随时间的变化表征出混合器在适合于单分子探测条件下的混合时间为150ms.

关键词：微流控混合单分子探测荧光共振能量传递蛋白质折叠金黄色葡萄球菌核酸酶

破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株构建

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生物工程学报 2008年第1期24卷 46-52页

作者：张君方宏清戴红梅谢达平陈惠鹏军事医学科学院生物工程研究所湖南农业大学理学院长沙410128

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良,构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌,该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽... 详细信息

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良,构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌,该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的*** nucleaseB(nucB)表达框整合至*** BL21(DE3)的lpxM位点,改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间,这样可使宿主核酸免受该酶"毒性"影响,菌体裂解后,nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。

关键词： E.coli BL2I(DE3) Red同源重组系统 IpxM 金黄色葡萄球菌核酸酶

大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）的改造 ——*** BL21（DE3）lpxM突变菌株的构建;破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌的构建

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大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）的改造 ——*** BL21（DE3）lpxM突...

作者：张君湖南农业大学

学位级别：硕士

本研究利用Red同源重组技术从分子水平对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行了改良——①使*** BL21(DE3)的lpxM基因发生插入失活，构建了lpxM突变菌株;②在lpxM位点敲入带有OmpA信号肽的金黄色葡萄球菌核酸酶基因，构建了破菌时可自... 详细信息

本研究利用Red同源重组技术从分子水平对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行了改良——①使*** BL21(DE3)的lpxM基因发生插入失活，构建了lpxM突变菌株;②在lpxM位点敲入带有OmpA信号肽的金黄色葡萄球菌核酸酶基因，构建了破菌时可自动降解宿主核酸的菌株。以期方便、有效地降低所表达重组蛋白的内毒素污染、核酸污染，以及降低因宿主菌染色体核酸释放导致的破菌液的黏度，为产品纯化和质量提高打下基础。 1、lpxM基因失活可以产生极低内毒素活性的脂多糖。构建同源臂500bp左右的打靶载体，借助Red同源重组系统，使*** BL21(DE3)的lpxM基因发生插入失活，再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20去除抗性基因。通过PCR鉴定发生插入突变的菌株，应用SDS-PAGE分析突变前后的脂多糖以及考查对重组蛋白表达的影响。PCR鉴定结果说明lpxM基因发生了插入突变。与出发株比较，突变株的脂多糖电泳图谱发生了明显变化，但其生长状态与表达重组蛋白的能力与出发株基本一致。为后续敲入外源功能基因，改造*** BL21(DE3)提供一个可行、方便的靶位点，同时该突变株生产的药用重组蛋白，引发内毒素反应的可能性大大降低。 2、构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌，高效、廉价地解决因宿主菌染色体核酸释放导致裂解液高粘度给后续纯化重组蛋白工作带来的困难，并减轻重组蛋白终产品中的核酸污染。在已证实lpxM基因失活对*** BL21(DE3)生长状态与表达重组蛋白的能力没有影响的基础上，将N端连有ompA的信号肽的*** nucleaseB(nucB)表达框整合至lpxM位点，所表达产物可转运至周质空间。改造后菌株——BLN经诱导能表达nucB、并存于周质空间，菌体裂解后能自动降解宿主核酸，降低裂解液黏度。与出发菌比较，其菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力不受影响。

关键词： E.coliBL21(DE3) Red同源重组系统 lpxM 金黄色葡萄球菌核酸酶周质空间

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