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金枪鱼肽可通过调节肠道菌群和系统炎症及肠道5-HT水平改善小鼠抑郁样行为

中国微生态学杂志 2023年第2期35卷 132-141,151页

作者：叶伟昌孙东方孙力军邓义佳房志家邓旗龚丽徐子淇汪雨馨韩美格广东海洋大学食品科技学院广东省水产品加工与安全重点实验室广东省海洋食品工程技术研究中心广东省海洋生物制品工程实验室水产品深加工广东普通高等学校重点实验室广东湛江524088 广东省现代农业装备研究所

目的考察金枪鱼肽对小鼠抑郁样行为的干预作用,并基于肠―脑轴初步解析金枪鱼肽的干预途径,为新一代抗抑郁食品或治疗剂的开发提供理论基础。方法通过44 d慢性不可预知性温和应激造模建立抑郁小鼠模型,于造模第15天起,每日灌胃一定剂... 详细信息

目的考察金枪鱼肽对小鼠抑郁样行为的干预作用,并基于肠―脑轴初步解析金枪鱼肽的干预途径,为新一代抗抑郁食品或治疗剂的开发提供理论基础。方法通过44 d慢性不可预知性温和应激造模建立抑郁小鼠模型,于造模第15天起,每日灌胃一定剂量金枪鱼肽,以蒸馏水为空白对照,鱼油为阳性对照。采用行为学指标评价小鼠抑郁样行为;分别采用酶联免疫法、鲎试剂法测定小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6及LPS水平;采用高效液相色谱―质谱法测定海马区、小肠组织和小鼠粪便中5-HT的水平;采用16SrRNA基因高通量测序和生物信息学方法考察小鼠粪便中肠道菌群组成变化。结果与模型组相比,金枪鱼肽组小鼠抑郁样行为得到显著改善且优于鱼油组。经过金枪鱼肽干预后,模型小鼠血清中显著升高的炎症因子和LPS水平得以恢复,海马区和小肠组织中显著降低以及粪便中显著升高的5-HT水平也恢复到空白组的水平;显著下降的肠道菌群丰富度得以提高;肠道菌群B/F比值由模型组的1.58升高到6.61,基本恢复至空白组水平;模型组显著降低的Muribaculaceae丰度及显著升高的Bacteroides、Alistipes丰度均恢复至空白组水平。结论金枪鱼肽可能通过调节肠道菌群和机体炎症及肠道5-HT水平改善慢性应激诱导的小鼠抑郁样行为,研究结果为金枪鱼肽开发成为新一代的绿色安全的抗抑郁食品提供了理论依据。

关键词：金枪鱼肽抑郁样行为炎症因子肠道菌群

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金枪鱼ACE抑制肽的筛选鉴定及其脂质体的构建

金枪鱼ACE抑制肽的筛选鉴定及其脂质体的构建

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作者：王金鑫烟台大学

学位级别：硕士

高血压是一种常见的慢性病,是人类过早死亡的重要诱因之一。抑制血管紧张素酶（ACE）的活性是调节血压的有效策略之一。然而,目前用于治疗高血压的合成药物虽然能有效地调节血压,但都存在一定的副作用,影响人体健康。安全有效地治疗高... 详细信息

高血压是一种常见的慢性病,是人类过早死亡的重要诱因之一。抑制血管紧张素酶（ACE）的活性是调节血压的有效策略之一。然而,目前用于治疗高血压的合成药物虽然能有效地调节血压,但都存在一定的副作用,影响人体健康。安全有效地治疗高血压仍是当前亟待解决的问题。食源性ACE抑制肽（ACEIPs）具有安全,作用温和,易吸收等特性,使之成为预防及治疗高血压疾病的研究热点。海洋生物资源丰富,被认为是新的具有治疗和营养保健功能的生物活性物质最有希望的来源。同时多项研究发现,口服蛋白或肽类营养补充剂,由于其易被消化道降解,细胞渗透性差等原因,导致其体内的生物利用率低,难以达到预期效果,严重限制了肽类产品的应用。本文基于上述问题展开研究,利用金枪鱼肉进行ACE抑制肽的制备,并对其生物活性、稳定性进行评价,通过细胞模型探明其在小肠中的吸收机制;通过构建载药脂质体,提高其稳定性及生物利用率,提高肽类产品的应用价值。最后,基于网络药理学对肽的潜在降血压作用靶点和机制进行发掘,为肽类产品应用于保健食品行业提供参考。主要研究内容和结果如下:1.以金枪鱼肉为原材料进行酶解制备ACEIPs,测定酶解物的氨基酸组成;使用Sephadex G-25凝胶色谱进行纯化,分析各组分生物活性及分子量分布,通过LC-MS/MS对其鉴定并筛选出潜在的ACEIPs,合成验证其生物活性,并考察了不同p H,温度和模拟体内消化对合成肽的影响,研究了合成肽的抑制类型,并通过分子对接研究了其结合机制。结果表明,金枪鱼酶解物中水解氨基酸含量为85.30±0.90%。纯化结果表明,组分Ⅲ具有较高的ACE抑制活性,为64.63±0.58%,其分子量分布主要集中在742～182 Da。经LC-MS/MS鉴定得到252条氨基酸序列,筛选合成10条,其中2条具有较高的ACE抑制活性,STHPHF(IC=30.71±0.18μg/m L),LTFSY(IC=20.72±0.15μg/m L)。两条肽在不同p H和不同温度下稳定,但在模拟胃肠道消化中会有一定损失。根据Linweaver-Burk曲线判断,STHPHF的抑制类型为混合型抑制,LTFSY为竞争型抑制。分子对接显示STHPHF和LTFSY两条肽主要通过氢键、疏水作用和静电作用等作用力与ACE活性口袋的氨基酸残基进行结合。2.通过构建Caco-2单层细胞模型,研究了LTFSY的跨膜渗透系数和吸收转运方式。使用旁路转运促进剂去氧胆酸钠、内吞抑制剂Wortmannin和肽转运载体竞争性抑制剂Gly-Pro研究了LTFSY的吸收方式;使用P-g P抑制剂维拉帕米,MRP1的特异性抑制剂MK-571和能量代谢抑制剂叠氮化钠研究了对LTFSY的外排的影响。结果表明,经过21天培养,Caco-2单层细胞模型跨膜电阻>400Ωcm,表明其建立成功。LTFSY在0～500μg/m L浓度下对Caco-2细胞无增殖毒性。LTFSY可以完整的被细胞吸收,其表观渗透系数为3.57×10cm/s。LTFSY的吸收方式主要为旁路转运。LTFSY在Caco-2细胞外排中可能有MRP蛋白参加并且需要能量。3.通过乙醇注入法制备了肽脂质体（LTFSY-Lip）,考察了磷脂浓度,胆固醇浓度,药物浓度对脂质体的影响。通过透射电镜,傅里叶红外光谱（FTIR）对最佳制备工艺的脂质体进行表征。考察了不同p H,温度条件下脂质体的稳定性及贮藏稳定性,探究了脂质体模拟体外消化和缓释实验,最后研究了脂质体的跨膜渗透效率。结果表明,乙醇注入法结合脂质体挤出器制备脂质体的工艺为:磷脂浓度20 mg/m L,胆固醇添加量4 mg/m L,样品浓度1 mg/m L,此条件下,肽脂质体的粒径117.57±0.55nm,PDI 0.180±0.009,电位-52.8±2.9 m V,包封率79.54±3.68%。透射电镜和红外结果表明肽被成功包封进入脂质体,并且脂质体呈圆球形。稳定性实验中,脂质体在中性p H和低温条件下会更稳定,在胃肠道消化中,对肽具有明显保护作用,并具有一定的缓释效果。同时可以提高约1.5倍细胞吸收效率。4.通过网络药理学、生物信息学和分子对接,对LTFSY进行分析,研究其降血压作用的潜在靶点及作用机制。结果表明,LTFSY与NOS3、AKT1、AGTR1、MMP9等多个核心靶点具有较高的结合稳定性,分子对接结合能均<5 kcal/mo L,LTFSY可能参与肾素-血管紧张素系统、流体剪切应力与动脉粥样硬化、HIF-1信号通路和Ca离子通道等多条通路调控血压。

关键词：金枪鱼肽 ACE抑制活性小肠吸收脂质体网络药理学

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