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金属螯合层析介质的研制及其在纯化重组人铜锌超氧化物歧化酶中的应用

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海军总医院院刊 1994年第3期7卷 162-164页

作者：朱迎春王晶翼谢邦铁骆训懿陈晓穗周丽君刘晓琳海军总医院分子生物学研究室

以琼脂糖Sepharose 4B为基质,经氯代环氧丙烷活化,与亚氨基二乙酸通过化学交联再与铜螯合,合成了金属铜螯合层析介质,结果显示此介质不仅具有特异性吸附能力,且有一定的刚性,对强碱和热亦有一定的耐受性.用此介质纯化人超氧化物歧化酶(r... 详细信息

以琼脂糖Sepharose 4B为基质,经氯代环氧丙烷活化,与亚氨基二乙酸通过化学交联再与铜螯合,合成了金属铜螯合层析介质,结果显示此介质不仅具有特异性吸附能力,且有一定的刚性,对强碱和热亦有一定的耐受性.用此介质纯化人超氧化物歧化酶(rhSOD),即可得到高纯度的rhSOD产品,简化了纯化工艺,降低了生产成本.

关键词：交联琼脂糖超氧化物歧化酶金属螯合层析

金属螯合亲和层析法对抗HBs Fab段的纯化

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中华微生物学和免疫学杂志 1996年第2期16卷 104-107页

作者：王琰刘群英化冰朱迎春王雅明徐建军海军总医院北京100037 北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤研究所

为了对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行简便有效的纯化，在Ｆａｂ段表达载体上插入了一段编码６个组氨酸的ＤＮＡ片段，使所表达的Ｆａｂ段在Ｆｄ段的梭基端带有６个连续的组氨酸，通过锌离子金属螯合亲和层析法对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进... 详细信息

为了对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行简便有效的纯化，在Ｆａｂ段表达载体上插入了一段编码６个组氨酸的ＤＮＡ片段，使所表达的Ｆａｂ段在Ｆｄ段的梭基端带有６个连续的组氨酸，通过锌离子金属螯合亲和层析法对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行纯化，利用不同ｐＨ梯度缓冲液洗脱，一步即可达到9５％Ｕ上纯度的纯化，为基因工程抗体的制备开发提供了有效手段。

关键词：单克隆抗体纯化金属螯合层析抗HBsFab

金属螯合亲和层析法纯化人源抗TNF—α重链可变区蛋白

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细胞与分子免疫学杂志 2000年第6期16卷 499-500页

作者：袁斌军事医学科学院微生物流行病研究所，北京100071

使用表达质粒pQE30,对已获得的人源抗TNF#alpha#抗体基因片段进行了高效表达,并用Ni-NTA金属螯合法对表达的抗体片段进行了纯化。

关键词：人源抗体肿瘤坏死因子纯化金属螯合层析

金属螯合亲和层析法对人源宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的纯化

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细胞与分子免疫学杂志 1998年第2期14卷 123-125页

作者：刘怀田黄策何君俞晓峰袁斌杜勇王海涛军事医学科学院微生物流行病研究所

在重组人宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的表达质粒（ｐＱＥＨｖ）的氨基端插入６个组氨酸，使其对金属螯合层析介质能产生特异性吸附，可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化。本研究采用ＮｉＮＴＡ螯合层析介质，以咪... 详细信息

在重组人宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的表达质粒（ｐＱＥＨｖ）的氨基端插入６个组氨酸，使其对金属螯合层析介质能产生特异性吸附，可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化。本研究采用ＮｉＮＴＡ螯合层析介质，以咪唑洗脱表达的蛋白。经ＥＬＩＳＡ检测，纯化的蛋白可特异地与抗宋内痢疾杆菌脂多糖的鼠ｍＡｂ５Ｂ１２发生反应。

关键词：人源抗体抗独特型脂多糖金属螯合层析抗体

固定化金属离子螯合琼脂糖凝胶的制备及其纯化组氨酸标签蛋白的研究

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固定化金属离子螯合琼脂糖凝胶的制备及其纯化组氨酸标签蛋白的研...

作者：李琼南京理工大学

学位级别：硕士

固定化金属离子亲和层析是一种纯化蛋白的优良方法。其中,固定化金属离子螯合琼脂糖凝胶纯化组氨酸蛋白的技术,近年来备受关注。这种方法主要利用共价作用固定在微球表面的配基与金属离子形成螯合物,蛋白质通过其表面基团与螯合物的配... 详细信息

固定化金属离子亲和层析是一种纯化蛋白的优良方法。其中,固定化金属离子螯合琼脂糖凝胶纯化组氨酸蛋白的技术,近年来备受关注。这种方法主要利用共价作用固定在微球表面的配基与金属离子形成螯合物,蛋白质通过其表面基团与螯合物的配位作用达到纯化蛋白的目的。具体研究内容如下： 1.以琼脂糖凝胶（Sepharose CL-6B）作为载体,环氧氯丙烷为活化剂,分别以亚氨基二乙酸和羧甲基天冬氨酸为螯合配基,制备了亲和层析介质Sepharose-CL-6B-IDA-Ni2+和SepharoseCL-6B-CM-ASP-Co2+。通过SEM分析得出：活化前后,琼脂糖的形貌并未发生改变,这说明琼脂糖微球在活化过程中粒子没有发生变形或破碎。并且探索了镍离子亲和层析介质的影响因素,研究发现：当环氧氯丙烷与基质的体积比为0.5,亚氨基二乙酸与基质的体积比为2,反应时间1h时,琼脂糖的活化效率最高。 2.将制备好的Sepharose-CL-6B-IDA-Ni2+和Sepharose-CM-ASP-Co2+介质用于纯化小规模六聚组氨酸融合蛋白,与商业化产品Ni-NTA介质进行比较,通过SDS-PAGE分析可知：Ni-IDA介质纯化效果最好,优于CM-ASP-Co2+介质和商业化产品Ni-NTA介质,纯化后目标蛋白几乎没有杂质,蛋白经过一次提纯就可得到纯度高的靶向蛋白。 3.合成螫合配基-N-（5-氨基-1-羧戊基）-亚氨基二乙酸,通过红外光谱和核磁谱等方法确定了产物的结构,采用N-（5-氨基-1-羧戊基）-亚氨基二乙酸作为螯合配基来纯化蛋白质的实验还有待进一步研究。制备好的Sepharose-CL-6B-IDA-Ni2+介质可商业化,用于纯化大规模的组氨酸蛋白。

关键词：金属螯合层析琼脂糖凝胶蛋白质纯化

大肠杆菌rpoH基因的克隆、表达及其产物的纯化

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生物化学与生物物理学报 1996年第2期28卷 170-176页

作者：陈于红华子春董晨马忠朱德煦南京大学生物化学系

本文用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌热休克蛋白转录因子σ３２的编码基因ｒｐｏＨ，并克隆在含有ｔａｃ启动子的表达载体ｐＵＨＥ中，经ＩＰＴＧ诱导，在大肠杆菌中表达了Ｃ端融合有６个寡聚组氨酸的σ３２。表达产物经金属螯合层析一步纯化... 详细信息

本文用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌热休克蛋白转录因子σ３２的编码基因ｒｐｏＨ，并克隆在含有ｔａｃ启动子的表达载体ｐＵＨＥ中，经ＩＰＴＧ诱导，在大肠杆菌中表达了Ｃ端融合有６个寡聚组氨酸的σ３２。表达产物经金属螯合层析一步纯化，达到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染一条带纯度，氨基酸组成分析及Ｎ端序列分析结果与文献报道一致。３５Ｓ细胞内参入实验表明：即使在较低的温度下，表达产物σ３２（Ｈｉｓ）６也能导致热休克蛋白如ＧｒｏＥｌ、ＤｎａＫ、Ｈｔｐ的大量合成．

关键词： σ32 热休克蛋白基因表达金属螯合层析

重组人干扰素α_(2b)和胸腺肽α_1融合蛋白的分离纯化

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北京化工大学学报（自然科学版） 2008年第5期35卷 82-84页

作者：罗琪陈劲春北京化工大学生命科学与技术学院北京100029

考察了大肠杆菌***表达的重组人干扰素α2b和胸腺肽lα融合蛋白包涵体的变性、复性及融合蛋白的分离纯化过程。实验结果表明:包涵体经7 mol/L盐酸胍,10 mmol/L DTT变性;1 mol/L尿素,2 mmol/L还原型谷胱甘肽,0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽脉... 详细信息

考察了大肠杆菌***表达的重组人干扰素α2b和胸腺肽lα融合蛋白包涵体的变性、复性及融合蛋白的分离纯化过程。实验结果表明:包涵体经7 mol/L盐酸胍,10 mmol/L DTT变性;1 mol/L尿素,2 mmol/L还原型谷胱甘肽,0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽脉冲加样稀释复性;金属螯合层析收集0.3 mol/L咪唑洗脱峰,冷干后经重组肠激酶30℃酶切24 h、Sephadex G-50柱纯化,可得到纯度达90%的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白,且最终目的融合蛋白产量达68 mg/g干菌体。

关键词：人干扰素α2b 胸腺肽αl 融合蛋白金属螯合层析

人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的真核表达、纯化及活性鉴定

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中国生物制品学杂志 2007年第10期20卷 725-728,740页

作者：刘建巨王建文宋娅莉哈尔滨医科大学附属第一医院眼科医院哈尔滨150001 北京华大基因研究中心GPA 组北京100001

目的利用毕赤酵母表达系统表达人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa),经纯化后,观察其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法采用PCR技术扩增出人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的全长cDNA序列,将其克隆至真核表达载体pPIC9K中,转化... 详细信息

目的利用毕赤酵母表达系统表达人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa),经纯化后,观察其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法采用PCR技术扩增出人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的全长cDNA序列,将其克隆至真核表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母KM71,以甲醇诱导表达,并进行Western blot检测及金属螯合层析纯化。采用MTT法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果重组表达质粒pPIC9K-Vasostatin(120～180aa)经菌落PCR、酶切和测序鉴定,证明构建正确。经Western blot检测可见一条特异条带,纯化后的蛋白纯度达88.76%,浓度为300μg/ml,在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的增殖。结论人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)可在毕赤酵母中以分泌形式表达,并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。

关键词：血管抑制因子真核表达金属螯合层析血管内皮细胞活性

洋葱伯克霍尔德氏菌L68邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、表达和纯化

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食品与生物技术学报 2006年第3期25卷 11-14页

作者：吕鹏刘大桅张长铠山东大学微生物技术国家重点实验室山东济南250100

采用自行设计的引物,从洋葱伯克霍尔德氏菌L68中PCR扩增得到phnE(邻苯二酚2,3-双加氧酶)基因,亚克隆到高表达载体pET 32a上,转入表达菌株中。经双向测序,证实构建过程中未出现突变。重组子经IPTG诱导后,可以表达有活性的重组双加氧酶。... 详细信息

采用自行设计的引物,从洋葱伯克霍尔德氏菌L68中PCR扩增得到phnE(邻苯二酚2,3-双加氧酶)基因,亚克隆到高表达载体pET 32a上,转入表达菌株中。经双向测序,证实构建过程中未出现突变。重组子经IPTG诱导后,可以表达有活性的重组双加氧酶。选择26℃进行重组蛋白诱导。薄层扫描显示,表达重组蛋白总量最高可占总蛋白的64.92%。利用金属螯合层析对重组蛋白进行了一步纯化,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白纯度达到95%。

关键词：洋葱伯克霍尔德氏菌邻苯二酚2,3-双加氧酶克隆表达金属螯合层析