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野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中一个与EPS合成有关的新基因的鉴定

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生物工程学报 2003年第6期19卷 661-667页

作者：陆光涛唐纪良何勇强陈保善唐东阶浙江大学农业与生物技术学院杭州310029 广西大学分子遗传研究所南宁530005

利用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonascampestrispv .campestris,简称Xcc)野生型菌株 80 0 4进行诱变 ,分离到一批胞外多糖 (EPS)合成减少的突变体。采用TAIL PCR(thermalasymmetricinter lacedPCR)分析突变体的Tn5gusA5插入位点 ,发现其中一株编号为 15 1D0 9的突变体的插入位点位于Xcc 80 0 4菌株的基因组编号为XC36 95的ORF内 ,该ORF功能尚未见报道。序列分析表明 ,该ORF演绎的编码产物与Serratiamarcescens的kdtX基因和Klebsiellapneumoniae的waaE基因演绎的编码产物分别具有 5 2 %和 5 0 %的相似性 ,并具有第 2家族糖基转移酶的功能域 ,因此暂将该ORF命名为waxE基因。用同源双交换方法构建了waxE基因的缺失突变体 ,并采用PCR和Southern杂交的方法对突变体进行了验证。waxE基因缺失突变体在营养丰富培养基的生长繁殖不受影响 ,但其EPS产量与野生型菌株 80 0 4相比 ,降低 35 %左右 ,并且一段PCR合成的包含waxE基因的DNA片段能反式互补waxE基因缺失突变体 ,恢复缺失突变体的EPS产量 ,表明XccwaxE基因与EPS的生物合成有关。

关键词：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种胞外多糖基因病原菌

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关

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生物工程学报 2004年第4期20卷 477-483页

作者：陆光涛唐纪良危广宁何勇强陈保善广西大学分子遗传研究所南宁530005

在以前的工作中 ,采用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xcc) 80 0 4菌株进行诱变 ,获得一批胞外多糖 (EPS)合成减少的突变体 ,对这些突变体的Tn5gusA5的插入位点进行分析后 ,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的... 详细信息

在以前的工作中 ,采用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xcc) 80 0 4菌株进行诱变 ,获得一批胞外多糖 (EPS)合成减少的突变体 ,对这些突变体的Tn5gusA5的插入位点进行分析后 ,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的突变体。以前认为wxcA基因与脂多糖 (LPS)的O 抗原合成有关而与EPS的合成无关。为明确wxcA基因的功能 ,对 80 0 4菌株的wxcA基因进行缺失 ,获得的ΔwxcA突变体的EPS产量与野生型菌株相比 ,减少了 5 0 % ,并且一段PCR合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补ΔwxcA突变体 ,恢复突变体的EPS产量。这证实了 80 0

关键词：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 wxcA基因胞外多糖

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的糖异生过程与致病相关

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野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的糖异生过程与致病相关

作者：何保仁广西大学

学位级别：硕士

获取营养是病原微生物与寄主相互作用的主要目的,碳源则是病原微生物必需的营养之一。葡萄糖是微生物主要利用的碳源之一,当环境中缺少可利用的六碳糖时,微生物会通过糖异生过程将非糖含碳化合物合成葡萄糖或6—磷酸葡萄糖。在细菌中一... 详细信息

获取营养是病原微生物与寄主相互作用的主要目的,碳源则是病原微生物必需的营养之一。葡萄糖是微生物主要利用的碳源之一,当环境中缺少可利用的六碳糖时,微生物会通过糖异生过程将非糖含碳化合物合成葡萄糖或6—磷酸葡萄糖。在细菌中一般存在两条糖异生路径:磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶途径(PCK)和苹果酸酶—磷酸烯醇式丙酮酸合成酶途径,从四碳二羧酸产生磷酸烯醇式丙酮酸是糖异生过程最重要的一步。通过基因组注释发现,野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株(Xcc8004)只有一条糖异生路径,也就是苹果酸酶—磷酸烯醇式丙酮酸合成酶途径。在本研究中,通过整合突变方法构建了磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因(ppsA)的非极性突变体NK1880。碳源利用检测显示,野生型菌株Xcc8004和互补菌株CNK1880能够在以琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸或乙酸作为唯一碳源的基本培养基上正常生长,而ppsA突变体都不能在以琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸或乙酸作为唯一碳源的基本培养基上正常生长。说明苹果酸酶—磷酸烯醇式丙酮酸合成酶途径是Xcc8004在糖异生过程中从四碳二羧酸合成磷酸烯醇式丙酮酸的唯一路径,这个结果和基因组注释的结果相符。利用剪叶法以浓度为OD≈0.1的菌液接种满身红萝卜(Raphanus sativus L. var. radiculus Pers.),十天后测量病斑长度,结果显示,

关键词：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种糖异生苹果酸酶-磷酸烯醇式丙酮酸合成酶途径致病性

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004的构建与表型鉴定

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野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004的构建与表型鉴定

作者：李贤祯广西大学

学位级别：硕士

多数植物病原细菌具有Ⅲ型分泌系统(TTSS)，它由hrp(hypersensitive reaction and pathogenicity)基因编码产物组成。其主要功能是在病原菌与寄主互作过程中，向寄主细胞内转运效应物蛋白。在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas ... 详细信息

多数植物病原细菌具有Ⅲ型分泌系统(TTSS)，它由hrp(hypersensitive reaction and pathogenicity)基因编码产物组成。其主要功能是在病原菌与寄主互作过程中，向寄主细胞内转运效应物蛋白。在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris ***，Xcc)中，hrp基因簇和大多数效应物基因的表达受调控基因hrpG的控制。这一表达调控系统在植物体内或诱导培养基XVM2中受诱导激活，而在丰富培养基NYG中表达受到抑制，因此限制了Xcc的TTSS相关的体外研究。为在Xcc全基因组范围内筛选新的效应物基因，本研究通过PCR定点突变技术构建了一个hrpG基因的E45K点突变体，命名为8004。研究显示8004能导致所有hrp基因在丰富培养基NYG上组成型表达，在非寄主植物辣椒ECW-10R上激发过敏反应的能力增强。菌体叶回收试验和培养基中生长动态测定的结果表明，无论在植物体内还是在培养基中8004的生长状况与Xcc 8004无明显差别。另外致病生化因子检测的结果表明，除胞外蛋白酶的分泌受抑制外，胞外多糖、胞外纤维素酶和胞外淀粉酶的产量均不受影响。本研究结果表明，由hrpG基因的E45K点突变构建的8004能成功引起hrp基因簇组成型表达，这为今后Xcc的体外研究奠定了基础。另外，本研究尝试了将8004用于Western杂交体系检测候选效应物蛋白的分泌。

关键词：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 hrp基因 8004* TTSS 效应物

野油菜黄单胞菌XC1892基因与致病力关系的分析

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广西农业生物科学 2008年第1期27卷 14-18页

作者：陆光涛陈蕾谢家日谭旖宁何勇强唐纪良广西大学生命科学与技术学院

野油菜黄单胞菌野油菜变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌。在前期工作中,从Xcc8004菌株获得1株编号为XC1892的基因的转座子Tn5gusA5突变体,其致病力降低。根据基因组注释,XC1892编码1个DsbE蛋白,参与细胞色素的合成。为评估XC1... 详细信息

野油菜黄单胞菌野油菜变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌。在前期工作中,从Xcc8004菌株获得1株编号为XC1892的基因的转座子Tn5gusA5突变体,其致病力降低。根据基因组注释,XC1892编码1个DsbE蛋白,参与细胞色素的合成。为评估XC1892的功能,采用自杀质粒pK18mob对XC1892进行诱变,获得非极性突变体1892nk。对突变体的表型分析发现,其致病力及胞外多糖产量分别是野生型的59%和55%。用一段包含XC1892基因的DNA片段对突变体1982nk进行功能互补,其致病力和胞外多糖产量基本得到恢复。这表明XC1892基因与Xcc的致病力和胞外多糖合成产量有关。

关键词：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 XC1892 致病力胞外多糖

野油菜黄单胞菌中酮酸还原异构酶（IlvC）生理功能研究

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野油菜黄单胞菌中酮酸还原异构酶（IlvC）生理功能研究

作者：李开怀华南农业大学

学位级别：硕士

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种属于黄单胞菌属,是十字花科植物病原菌,能通过群体感应系统调节很多毒力因子的产生,从而使植物感染黑腐病。尽管黄单胞菌中DSF信号分子的合成机理已相对清楚,但是DSF信号家族中,支链信号分子的前体来源还... 详细信息

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种属于黄单胞菌属,是十字花科植物病原菌,能通过群体感应系统调节很多毒力因子的产生,从而使植物感染黑腐病。尽管黄单胞菌中DSF信号分子的合成机理已相对清楚,但是DSF信号家族中,支链信号分子的前体来源还未明晰,同时黄单胞菌中支链脂肪酸的合成机制也还有待阐明。大肠杆菌(Escherichia coli)酮酸还原异构酶基因(Ec ilv C)是支链氨基酸从头合成的关键基因,能够以NADPH为辅因子催化2-乙酰乳酸或2-乙酰-2-羟基丁酸合成2,3-二羟基异戊酸或2,3-二羟基-3-甲基戊酸,从而进入支链氨基酸合成途径。黄单胞菌中也发现同源基因Xcc ilv C。本研究通过体外试验证明了Xcc IlvC蛋白能催化2-乙酰乳酸形成2,3-二羟基异戊酸。Xcc ilv C基因突变株表现为支链氨基酸营养缺陷型,且不能通过糖代谢途径从头合成支链脂肪酸。群体感应信号分子检测同样发现,Xcc ilv C基因突变株不能通过糖代谢途径从头合成支链信号分子DSF和IDSF。本研究还证明了Xcc ilv C基因突变后显著性降低黄单胞菌对宿主植物的致病性;胞外酶及信号分子分析显示,致病性的降低不是由于胞外致病因子的分泌减少,而是由于突变株Xcc△ilv C信号分子减少所致。另外,本研究显示,外源添加不同的碳氮组分能够不同程度的影响DSF家族群体感应信号分子的合成。本研究系统阐述了支链脂肪酸糖代谢从头合成与群体感应信号分子的关系,同时鉴定了Xcc IlvC在支链脂肪酸合成、群体感应信号分子的合成以及致病性方面的功能。

关键词：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种支链脂肪酸酮酸还原异构酶 DSF

野油菜黄单胞菌bioC和bioH基因功能研究

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野油菜黄单胞菌bioC和bioH基因功能研究

作者：陈群一华南农业大学

学位级别：硕士

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris ***,Xcc)是十字花科黑腐病的病原菌,其危害严重,因此迫切需要研发新型抗黑腐病药物。生物素是生物体内许多酶的辅因子,参与到多种代谢途径中,对生物的正常生长和生理活动至关重要... 详细信息

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris ***,Xcc)是十字花科黑腐病的病原菌,其危害严重,因此迫切需要研发新型抗黑腐病药物。生物素是生物体内许多酶的辅因子,参与到多种代谢途径中,对生物的正常生长和生理活动至关重要。在病原菌中,生物素的合成与其致病力密切相关,因此生物素合成途径已成为一个极具潜力的新型抗菌药物的作用靶标。因此,本论文研究了野油菜黄单胞菌中生物素合成的机制以及丙二酸单酰ACP甲基转移酶(Bio C)和甲酯庚二酸单酰ACP酯酶(Bio H)的生理功能。本文第一部分是关于野油菜黄单胞菌bio C和bio H的鉴定和功能研究。通过生物信息学分析,在Xcc中,Xcc0383和Xcc1678都标注为丙二酸单酰ACP甲基转移酶(Bio C)基因,而Xcc0385标注为甲酯庚二酸单酰ACP酯酶(Bio H)基因,这是首次发现在同一细菌基因组中存在2个基因可能编码Bio C蛋白,此现象在其他种属中的细菌都未发现过。首先将Xcc0383、Xcc1678和Xcc0385导入大肠杆菌(Escherichia coli)Δbio C和Δbio H基因突变株,结果显示只有Xcc0383能恢复ΔEcbio C突变株在基础培养基上的生长,初步表明Xcc0383编码蛋白具有Ec Bio C类似的功能,而Xcc0385能恢复ΔEcbio H突变株的生长,初步表明Xcc0385编码蛋白具有Ec Bio H类似的功能其次,分别构建Xcc0383、Xcc1678和Xcc0385敲除突变株,结果发现敲除Xcc0383和Xcc0385后突变株为生物素营养缺陷型菌株,但敲除Xcc1678对Xcc的生长并无影响。而Xcc0383和Xcc0385的回补突变株都能恢复到野生菌的生长表型,进一步确定在Xcc中Xcc0383和Xcc0385编码蛋白分别具有Bio C和Bio H活性。再次,在大肠杆菌中异体表达Xcc0385,并利用亲和层析法纯化获得Xcc0385蛋白,体外构建酶促反应,结果显示Xcc0385蛋白能将甲酯庚二酸单酰ACP去甲基化,生成庚二酸单酰ACP,再次说明Xcc0385蛋白具有Bio H活性。最后,检测突变株的致病力、致病相关因子以及抗逆性的变化。敲除Xcc0383和Xcc0385后Xcc侵染甘蓝的能力下降,而敲除Xcc0383后胞外蛋白酶的分泌量下降,突变株对逆境耐受性显著弱于Xcc野生菌株。结果表明阻断Xcc的生物素合成后,其致病力有所下降。而Xcc0383通过生物素合成以外的机制影响着胞外蛋白酶的分泌与对逆境的耐受性。综合上述结果,在Xcc中Xcc0383和Xcc0385分别编码Bio C和Bio H蛋白,并参与到生物素合成途径当中;敲除Xcc0383和Xcc0385后,Xcc无法自身合成生物素,致病力下降;Xcc0383还与致病因子的产量和逆境耐受性相关。本文第二部分对野油菜黄单胞菌中bio C、fab G和bio H之间的关系进行探索。通过生物信息学发现,在Xcc0383和Xcc0385之间存在Xcc0384基因,标注编码3-酮脂酰ACP还原酶(Fab G),Fab G在脂肪酸合成中具有催化3-酮脂酰ACP还原成3-羟脂酰ACP的功能,但目前Xcc0384的生理功能仍然未知,且此基因簇在黄单胞菌属中其他菌种均有出现具有保守性,因此本文开展了对Xcc0383、Xcc0384和Xcc0385的研究,探索三者之间的关系。首先,构建Xcc0384表达载体,发现Xcc0384无法使大肠杆菌fab G温敏突变株CL104在42℃下生长。而表达纯化Xcc0384蛋白,体外构建酶促反应也发现Xcc0384无法催化脂肪酸合成反应的进行,表明Xcc0384并不具备3-酮脂酰ACP还原酶的活性。其次,分别构建ΔXcc0383ΔXcc0384和ΔXcc0384ΔXcc0385双基因敲除菌株以及ΔXcc0383ΔXcc0384ΔXcc0385突变株,发现双突变株ΔXcc0383ΔXcc0384的生长显著慢于Xcc野生菌株和其他突变株,且在基础培养基中外源添加生物素仍无法生长,但可利用外源庚二酸维持生长;ΔXcc0383ΔXcc0384对Xcc野生菌株有轻微的抑菌作用;在ΔXcc0384ΔXcc0385中共回补Xcc0384和Xcc0385后,其长势要优于单独互补Xcc0385;Xcc0384敲除后,突变株的致病表型无明显变化。根据上述结果提出下列假设,在Xcc中Xcc0385除负责生物素合成外,还参与到其他物质代谢途径中,催化产生的某种毒性物质,而Xcc0384则负责还原降解毒性物质;Xcc0384与吸收利用外源庚二酸相关。

关键词：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种生物素合成丙二酸单酰ACP甲基转移酶甲酯庚二酸单酰ACP酯酶 3-酮脂酰ACP还原酶

野油菜黄单胞菌8004与胞外多糖合成相关基因的鉴定

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野油菜黄单胞菌8004与胞外多糖合成相关基因的鉴定

作者：何飞燕广西大学

学位级别：硕士

野油菜黄单胞菌野菜致病变种(Xanthomonas campestris ***，以下简称Xcc)是一种能在全球范围内引起十字花科植物黑腐病的病原性细菌。胞外多糖是Xcc的重要致病因子之一，也是一种重要的工业多糖。本实验室已构建了Xcc 8004的Tn5gusA5插... 详细信息

野油菜黄单胞菌野菜致病变种(Xanthomonas campestris ***，以下简称Xcc)是一种能在全球范围内引起十字花科植物黑腐病的病原性细菌。胞外多糖是Xcc的重要致病因子之一，也是一种重要的工业多糖。本实验室已构建了Xcc 8004的Tn5gusA5插入突变库，并对16462株突变体的EPS产量进行了平板检测，获得了75株胞外多糖产量下降突变株。本工作用2％葡萄糖的NYGA平板上检测，对这75个突变体进行了重新筛选，得到了51株胞外多糖缺陷的突变体，它们分布在45个ORF中。其中11个ORF前人已证实与胞外多糖合成有关：34个ORF未报道与胞外多糖的产生相关，这34个ORF中13个编码的为假设保守蛋白。本工作选择这13个编码的为假设保守蛋白的基因的一个，编号为XC0877，进行进一步研究，以确定该ORF是否与EPS合成有相关。根据Xcc 8004的Tn5gusA5插入突变库的资料，XC0877 ORF中有四个独立的Tn5gusA5插入突变体，其中有两个突变体为胞外多糖缺陷型，另两个突变体为胞外多糖产生正常。我们初步认为这种表型不一致的原因有可能是ORF界定有误。为了确证XC0877 ORF与胞外多糖产生的关系，我们采用同源单交换的方法构建了该ORF的非极性定点整合突变体。并对所得突变体进行了胞外多糖产量检测，出乎意料的是在这些突变体中大约有一半表现为缺陷型而另一半则表现为胞外多糖产生正常。用PCR方法扩增野生型XC0877 ORF(包括启动子)，并克隆到pLAFR3上，进行反式互补，结果未能恢复突变体的胞外多糖的产量。综合以上结果，XC0877 ORF是否与胞外多糖产生有关还需进一步研究。

关键词：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种胞外多糖 Th5gusA5插入突变体非极性定点插入突变

野油菜黄单胞菌XC3813-3815基因启动子的定位分析

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广西农业生物科学 2008年第2期27卷 104-109页

作者：陆光涛彭方印李彩月唐永勤安世琦何勇强唐纪良广西大学生命科学与技术学院广西南宁530005

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌,同时也是发酵工业生产黄原胶的菌种。在以前的工作中,证实了Xcc8004菌株基因组中一个包含XC3813-3815三个基因的新位点与致病性和胞外多糖(EPS,又称黄原胶)合成有... 详细信息

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌,同时也是发酵工业生产黄原胶的菌种。在以前的工作中,证实了Xcc8004菌株基因组中一个包含XC3813-3815三个基因的新位点与致病性和胞外多糖(EPS,又称黄原胶)合成有关。本工作通过PCR合成包含相应ORF及其上游不同长度的DNA片段,并克隆于不带启动子的质粒载体pLAFR6后,将所获的重组质粒互补相应的突变体。通过这一功能互补的方法,确定了这三个基因在其ORF上游约50bp内分别拥有自身的启动子。

关键词：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 XC3813-3815 启动子