检索结果-南通市图书馆

鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

黑龙江畜牧兽医 2022年第8期 75-81页

作者：梅胜尧张玉堂张逸民孙宝海刘晶江苏省药物研究所有限公司江苏省药物安全性评价中心南京210018

为了建立一种简单、快速鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的方法,试验根据Gen-Bank中CDV野毒株与疫苗株H基因序列设计鉴别检测引物,建立鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性及符合性;利用建... 详细信息

为了建立一种简单、快速鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的方法,试验根据Gen-Bank中CDV野毒株与疫苗株H基因序列设计鉴别检测引物,建立鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性及符合性;利用建立的鉴别CDV野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR检测方法对2017—2020年采集于江苏省11个不同地市的505份发病犬喉拭子样品和病料样品进行检测,确定CDV野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR的临床适用性。结果表明:该方法对CDV野毒株、CDV疫苗株、CDV野毒株/疫苗株可分别扩增出477 bp、677 bp、477 bp/677 bp的特异性条带,而检测犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV)均为阴性;该方法的检测灵敏度为23.1 pg RNA;与RFLP方法的符合率为100%;批内重复性检测和批间重复性检测的结果完全一致;利用该方法检测505份临床样品,CDV野毒株和疫苗株的阳性率分别为8.91%和72.48%。说明建立的鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性和临床适用性。

关键词：犬瘟热病毒野毒株疫苗株一步法RT-PCR 检测方法应用

基于CRISPR/Cas12a系统鉴别PEDV野毒株与疫苗株检测方法的建立与应用

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

基于CRISPR/Cas12a系统鉴别PEDV野毒株与疫苗株检测方法的建立与...

作者：李雅男安徽农业大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种肠道冠状病毒,可造成猪只及未断奶仔猪急性水样腹泻和呕吐,致病性强,死亡率高,使得猪生产行业遭受严重的经济危机,实现对猪流行性腹泻病毒的快速现场检测是重大的产业需... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种肠道冠状病毒,可造成猪只及未断奶仔猪急性水样腹泻和呕吐,致病性强,死亡率高,使得猪生产行业遭受严重的经济危机,实现对猪流行性腹泻病毒的快速现场检测是重大的产业需求。现有PEDV的检测方法主要有病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附、聚合酶链式反应等,尽管在检测PEDV时这些手段起到了很大的帮助,但是它们仍然有着检测时间长、操作较为繁琐、对仪器设备要求高等缺陷,更重要的是在中国商业猪场里PEDV疫苗被广泛应用,但猪注射后易产生持续排毒,且不能完全免疫所有突变的野生型毒株,实验室检测时常无法快速鉴别野毒株与疫苗株。这些技术除了无法准确鉴别PEDV野毒株与疫苗株外,其存在的缺陷也阻碍了PEDV现场快速检测的应用与普及。因此,建立一种快速、易操作、灵敏且对设备要求低的临床检测方法具有重要的现实意义。CRISPR/Cas系统是一种存在于大多数细菌与所有的古菌中的防御机制,以消灭外来的质体或者噬菌体的DNA,广泛应用于基因工程中。近年来科学家们发现II类Cas蛋白Cas12a具有cr RNA指导的靶DNA激发的非特异性ss DNA切割活性,并将CRISPR-Cas系统应用于核酸检测领域,成为了体外诊断领域的研究热点。逆转录酶促重组酶扩增技术(RT-ERA)是通过逆转录酶、重组酶和单链结合蛋白,在恒定温度的设定下对模板上的目的基因进行指数式扩增,它突破了精密控温设备的限制。此外层析式双抗体夹心试纸条技术具有快速、便携的特点,将其与CRISPR/Cas12a技术结合,有望克服现有病原检测技术耗时长、操作繁琐、对仪器设备要求高等缺陷,带来更灵敏、特异、即时、简便的检测。CRISPR/Cas12a系统用于鉴别PEDV野毒株与疫苗株的研究目前未见报道,因此本研究利用CRISPR/Cas12a系统、RT-ERA等温扩增技术、荧光分析及试纸条信号输出等方式,针对PEDV的ORF3序列构建鉴别野毒株与疫苗株的快速检测方法。本研究主要内容如下:1.四株PEDV野毒株的ORF3基因的遗传进化分析本研究在检测结果为阳性的病料中选取4份病料,通过测序比对后得到4组ORF3基因序列,并将序列上传至NCBI数据库中。与24株PEDV毒株比较后,可知本研究所检测的4株毒株均属于G2型,且与疫苗株CV777的亲缘关系较远。本研究对PEDV野毒株的ORF3基因进化动向提供了参考依据。2.CRISPR/Cas12a可视化系统检测方法的建立本文建立了一种基于CRISPR/Cas12a系统的鉴别PEDV野毒株与疫苗株的检测方法。根据Gen Bank中公布的PEDV ORF3基因序列,使用Prime Premier 5.0软件设计了全长引物,构建了重组质粒p MD-19T-ORF3;针对PEDV野毒株与疫苗株在ORF3序列上的缺失部位设计2对cr RNA引物对、3对RT-ERA引物和探针,并对这些引物进行筛选,而后用筛选后的引物进行反应温度和时间的优化;以重组质粒为模板进行灵敏度及特异性试验。试验结果表明:第2对cr RNA引物对和第一对RT-ERA引物的效果较好,并用于下游试验;对反应条件进行优化后,最佳反应时间和温度分别为30 min和37℃;该试验的灵敏度达2 copies/μL,比q PCR高出10倍,且与其他病原没有交互性,并在对临床样品的检测中显示出较高的精确度,整个检测流程仅需60 min。3.CRISPR-LF检测方法的建立本研究在上述CRISPR可视化检测体系的基础上引入了层析式双抗体夹心试纸条技术,建立了一种CRISPR-Lateral flow strip(CRISPR-LF)检测方法,可通过裸眼检测,用CRISPR荧光检测体系筛选后的cr RNA引物和RT-ERA引物进行反应温度和时间的优化;以重组质粒为模板进行灵敏度及特异性试验。对反应条件进行优化后,最佳反应时间和温度分别为30 min和37℃;该试验的灵敏度达2×10 copies/μL,并在临床样本的检测时表现出良好的准确性和专一性。综上所述,本研究的建立的基于CRISPR/Cas12a系统鉴别PEDV野毒株与疫苗株检测方法与传统PCR和q PCR相比具有高灵敏度、强特异性、快速高效的特点,同时提高了检测的便携性,适合于试验资源匮乏的现场检测,在分子POCT检测领域具有良好的发展前景,对于PEDV早期诊断和预防控制具有重要意义。

关键词：猪流行性腹泻病毒 CRISPR/Cas12a 野毒株疫苗株快速检测遗传进化分析

PCR－RFLP用于Ⅰ型脊髓灰质炎病毒野毒株与疫苗相关株的鉴别

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

中华微生物学和免疫学杂志 1996年第5期16卷 381-384页

作者：孔健章美云卫生部北京生物制品研究所

利用互补于Ⅰ型脊髓灰质炎病毒ＶＰ１区的一对引物，扩增病毒核酸中约２６８ｂｐ的片段。产物经ＨａｅⅢ、ＲｓａⅠ、ＸｂａⅠ三种限制性内切酶切割后，用２％琼脂糖凝胶电泳检测，观察各分离株与ＳａｂｉｎⅠ型株酶切图谱的异同。在所... 详细信息

利用互补于Ⅰ型脊髓灰质炎病毒ＶＰ１区的一对引物，扩增病毒核酸中约２６８ｂｐ的片段。产物经ＨａｅⅢ、ＲｓａⅠ、ＸｂａⅠ三种限制性内切酶切割后，用２％琼脂糖凝胶电泳检测，观察各分离株与ＳａｂｉｎⅠ型株酶切图谱的异同。在所检测的１３株病毒分离株中，只有１株的酶切图谱与ＳａｂｉｎⅠ型株的相同，为疫苗相关株，其它的１２株均为野毒株。本实验的结果表明从不同地区、不同年份所得的Ⅰ型脊髓灰质炎病毒分离株的碱基组成是有差异的。

关键词： Ⅰ型脊髓灰质炎病毒 PCR 野毒株疫苗相关性

Sabin株和野毒株脊髓灰质炎灭活疫苗在恒河猴体内不同免疫方案的比较

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国生物制品学杂志 2013年第6期26卷 750-753页

作者：杨卉娟陈俊英和占龙李华杨耀云叶君岳俊孙强明施海晶马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大疾病传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的评价Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV)和野毒株脊髓灰质炎灭活疫苗(Wild strain inactivated poliovirus vaccine,wIPV)在恒河猴体内不同免疫方案的免疫原性。方法将25只恒河猴随机分为5组:sIPV组(免疫3剂sIPV)、sIPV/口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral attenuated poliovirus vaccine,OPV)组(免疫2剂sIPV后,再免疫2剂OPV)、wIPV组(免疫3剂wIPV)、wIPV/OPV组(免疫2剂wIPV后,再免疫2剂OPV)和对照组(免疫3次稀释液M199),每组5只。OPV口服接种,IPV和M199经上臂三角肌处肌肉注射,2剂间免疫间隔时间为1个月。首次免疫前和每剂免疫后1个月采血,分离血清,采用微量中和试验法测定血清中抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体效价。结果除对照组外的4个试验组全程免疫结束后,恒河猴血清中均可检出较高水平的中和抗体,且所有恒河猴血清中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体全部阳转。Ⅰ型和Ⅲ型抗体免疫应答中,接种sIPV的2个试验组中和抗体水平高于接种wIPV的2个试验组(P0.05),Ⅲ型抗体第4剂免疫后水平也有所上升。结论 sIPV和wIPV在恒河猴体内均可诱导良好的免疫应答,初步证实了IPV/OPV序贯免疫的可行性,为今后免疫策略的制定提供了一定的实验依据。

关键词：脊髓灰质炎灭活疫苗 Sabin株野毒株序贯免疫中和抗体

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株微滴数字PCR鉴别方法的建立

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国预防兽医学报 2018年第12期40卷 1137-1141,1156页

作者：兰德松魏澍顾贵波侯振中东北农业大学动物医学院/农业部动物疫病病原生物学重点实验室黑龙江哈尔滨150030 辽宁省动物疫病预防控制中心辽宁沈阳110164 辽宁省动物医学研究院辽宁沈阳110164

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本... 详细信息

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本研究建立的dd PCR方法能够特异性地鉴别检测PRV野毒株和疫苗株,与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应;该方法针对PRV gD、gE基因的检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL,分别比相应的荧光定量PCR (qPCR)方法敏感性高10倍和5倍;针对PRV gD、gE基因的批内和批间重复性试验结果变异系数(C.V)均小于4%;通过对45份临床样品的检测,结果显示,与病毒分离方法相比,dd PCR方法敏感性为91.7%,特异性为97.2%,符合率为97.8%;与dd PCR方法相比,q PCR的敏感性为83.3%,特异性为94.3%,符合率为95.6%。本研究建立的dd PCR方法在检测低拷贝临床样品时敏感性更高、特异性强、重复性好,可以作为PRV野毒株与疫苗株的鉴别、准确定量的有效检测手段。

关键词：伪狂犬病病毒野毒株 gE基因缺失疫苗株微滴数字PCR 鉴别定量检测

水貂肠炎病毒疫苗株和野毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国兽医科学 2012年第3期42卷 264-267页

作者：王建科程世鹏杨莘易立许红丽程悦宁师新川武华闫喜军中国农业科学院特产研究所、吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室吉林长春130122

为了建立水貂肠炎病毒(MEV)疫苗株与野毒株的鉴别检测方法,根据GenBank中的水貂肠炎病毒序列设计了1对引物,用来扩增包含水貂肠炎病毒NS1基因在内的2 013bp大小的片段。通过对国内疫苗毒MEVB株及其他细小病毒参考株的NS1基因序列比较发... 详细信息

为了建立水貂肠炎病毒(MEV)疫苗株与野毒株的鉴别检测方法,根据GenBank中的水貂肠炎病毒序列设计了1对引物,用来扩增包含水貂肠炎病毒NS1基因在内的2 013bp大小的片段。通过对国内疫苗毒MEVB株及其他细小病毒参考株的NS1基因序列比较发现,疫苗毒MEVB株NS1基因核苷酸1401位的碱基由T变为C,致使1399位～1404位的核苷酸构成由ATTGAT变异为ATCGAT,多了1个限制性内切酶ClaⅠ酶切位点,其他MEV分离毒株中均未出现此酶切位点。用特异性引物扩增出2 013bp的目的片段后,再用限制性内切酶ClaⅠ进行酶切分析,疫苗毒MEVB株被切割成1 404bp和609bp的2个片段,国内其他分离株均未出现上述片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗毒MEVB株和野毒株。

关键词：水貂肠炎病毒聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测法疫苗株野毒株

猪瘟病毒野毒株与疫苗株E2基因双重TaqMan real-time PCR鉴别检测方法的建立

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国兽医学报 2015年第12期35卷 1898-1902页

作者：杜冬华薛拥志王爱华周静孙全文邱殿锐郭建军河北北方学院动物科技学院河北张家口075131 承德市畜牧研究所河北承德067000

为建立猪瘟病毒（CSFV）野毒株和疫苗株快速定量鉴别检测方法，根据CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差异，设计了2对特异性引物及1条TaqMan探针，以含CSFV HB株和C-株E2基因的重组质粒pBS-E2C和pBS-E2作为标准品，建立了能同时检测CSFV野... 详细信息

为建立猪瘟病毒（CSFV）野毒株和疫苗株快速定量鉴别检测方法，根据CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差异，设计了2对特异性引物及1条TaqMan探针，以含CSFV HB株和C-株E2基因的重组质粒pBS-E2C和pBS-E2作为标准品，建立了能同时检测CSFV野毒株和疫苗株的双重TaqMan real-time PCR鉴别检测方法。结果表明，建立的CSFV双重TaqMan real-time PCR标准曲线Ct值与1×10^1-l×10^6 copies／μL，之间的E2基因拷贝数呈良好的线性关系，灵敏度达10copies／μL，且特异性和重复性很好。综上，本试验建立的TaqMan real-time PCR检测方法可用于CSFV野毒株和疫苗株的鉴别诊断及病原定量分析。

关键词：猪瘟病毒双重荧光定量PCR TaqMan探针野毒株疫苗株

伪狂犬病病毒野毒株与疫苗株的实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国兽医科学 2015年第7期45卷 680-685页

作者：张志樊雅婷吴发兴刘爽董雅琴邵卫星段纲王树双李晓成中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032 云南农业大学云南昆明650201

针对伪狂犬病病毒疫苗株基因组缺失的3.5kb片段,设计3套引物和探针,并用标准的伪狂犬病病毒野毒株和疫苗毒株进行测试,建立了一种新的快速鉴别伪狂犬病病毒野毒株和疫苗株的实时荧光定量PCR方法。该方法的检测极限可达10copies/μL,并... 详细信息

针对伪狂犬病病毒疫苗株基因组缺失的3.5kb片段,设计3套引物和探针,并用标准的伪狂犬病病毒野毒株和疫苗毒株进行测试,建立了一种新的快速鉴别伪狂犬病病毒野毒株和疫苗株的实时荧光定量PCR方法。该方法的检测极限可达10copies/μL,并与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒等不存在交叉反应现象,批内和批间重复性试验的变异系数分别为1.70%±1.07%和2.22%±1.02%,显示该方法具有良好的重复性。在对临床20份样品的检测时,该荧光定量PCR的阳性率为60%,普通PCR的阳性率仅为40%。结果表明,该方法具有特异性高、敏感性强的特点,是一种值得推广的快速诊断技术,可用于猪伪狂犬病的诊断和流行病学调查等。

关键词：伪狂犬病病毒野毒株疫苗株实时荧光定量PCR 鉴别

乙脑病毒野毒株SA14感染性克隆的构建及病毒拯救

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国病原生物学杂志 2018年第9期13卷 945-948页

作者：冷生玲黄荣冯亚岚唐丽萍周仲辉陈大斌杨健川北医学院基础医学院病原生物学与免疫学实验教学中心四川南充637000 川北医学院附属医院感染科绵阳市中心医院感染科

目的构建乙脑病毒野毒株SA14感染性克隆并进行病毒拯救。方法分节段合成乙脑病毒野毒株SA14全长cDNA序列,采用分段连接方式构建SA14全长cDNA质粒,以其为模板体外转录RNA并电转染导入BHK21细胞进行病毒拯救,用噬斑试验和间接免疫荧光法... 详细信息

目的构建乙脑病毒野毒株SA14感染性克隆并进行病毒拯救。方法分节段合成乙脑病毒野毒株SA14全长cDNA序列,采用分段连接方式构建SA14全长cDNA质粒,以其为模板体外转录RNA并电转染导入BHK21细胞进行病毒拯救,用噬斑试验和间接免疫荧光法鉴定拯救病毒;绘病毒生长曲线,测定拯救病毒对小鼠的神经毒力。结果酶切鉴定质粒模板成功构建,用免疫荧光法检测到恢复病毒包膜蛋白表达,噬斑实验发现乙脑野毒株噬斑直径大于疫苗株;绘制病毒生长曲线,野毒株和疫苗株均在60h达到高峰。用拯救病毒进行动物感染试验,野毒株对小鼠脑内神经毒力LD50为10-1.07,皮下神经毒力LD50为100.33。结论成功建立乙脑野毒株SA14感染性克隆并拯救病毒,为进一步研究乙脑病毒的致病机制等奠定了基础。

关键词：乙脑病毒野毒株感染性克隆