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生物化学与生物物理进展 2000年第6期27卷 655-657页

作者：周佳海陈海宝中国科学院上海有机化学研究所

介绍了一个简便的DNA改组操作程序 .首先利用pcr扩增了两段具有高度序列同源性的 170 0bp左右的基因片段 ,两者相比较同源性大于 93 % .然后将其等量混合后 ,在Mg2 +存在的条件下 ,用DNaseⅠ切割成 10～5 0bp的小片段 .这些小片段在不... 详细信息

介绍了一个简便的DNA改组操作程序 .首先利用pcr扩增了两段具有高度序列同源性的 170 0bp左右的基因片段 ,两者相比较同源性大于 93 % .然后将其等量混合后 ,在Mg2 +存在的条件下 ,用DNaseⅠ切割成 10～5 0bp的小片段 .这些小片段在不外加引物的前提下 ,利用pcr反应进行重聚 ,再将重聚物经过两轮正常的pcr扩增 ,获得了与原来片段大小相当的基因片段 .

关键词： DNA改组重聚pcr 定向进化操作程序

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一种基于构件重组原理构建基因文库方法的研究

一种基于构件重组原理构建基因文库方法的研究

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作者：黄河青青岛科技大学

学位级别：硕士

酶的定向进化能够取得成功的两个关键是建立多样性突变库的和有高效的筛选系统,本文中利用agaB在表达时可以水解琼脂糖的特性构建了一种高效率的组成型表达筛选载体,基于构建重组的原理利用共用接头互补重聚构建了一个大容量的基因文库... 详细信息

酶的定向进化能够取得成功的两个关键是建立多样性突变库的和有高效的筛选系统,本文中利用agaB在表达时可以水解琼脂糖的特性构建了一种高效率的组成型表达筛选载体,基于构建重组的原理利用共用接头互补重聚构建了一个大容量的基因文库。 1.利用稳定性和转化效率高的pBluescript II KS （+）克隆载体质粒作为构建载体的母核,插入agaB启动子构建组成型表达载体,并利用pET-24a（+）上的酶切位点对表达载体上的酶切位点进行改造,再插入agaB基因构建组成型筛选载体。由于agaB基因表达时能在固体LB培养基上产生水解圈,双酶切后的载体连接目的片段在固体LB培养基上进行表达时,有水解圈的即为双酶切不完全的假阳性克隆,而没有水解圈的单克隆为连接了目的基因的阳性克隆。利用卡那霉素抗性基因检验筛选载体的效果。挑取16个无水解圈的菌落进行pcr特异性扩增后,经凝胶电泳鉴定有15个是阳性克隆,筛选效率达到90%以上,比传统载体筛选效率高很多,且不需要蓝白斑筛选,简化了实验步骤,减少了实验成本。 2.大容量基因文库的构建:首先设计长度为21个碱基的两条随机序列,作为实验组合的基本模块,并在随机序列的两端分别设计九个碱基,这九个碱基顺向互补,作为一个通用的连接接头,在pcr重聚时相互作为引物。选用的九个碱基是可编码形成柔性氨基酸（linker）的碱基序列。随机序列中间的21个碱基是随机的,编码7个氨基酸,达到形成一个蛋白模序（motif）所需要的氨基酸数目。因此,随机序列通过pcr重聚就可以得到一个能够编码大量蛋白质的一个随机基因文库。在重聚过程中为了防止重聚片段过长,在重聚pcr达到一定的循环数后,在反应体系中加入一定比例的终止序列,由于终止序列是特异性的序列,在重聚延伸至此序列后,不再互补,重聚pcr反应终止,得到合适大小的基因片段。对反应体系和反应程序进行优化后确定最佳实验条件,然后利用常规分子生物学手段检验基因文库的多样性。利用生物信息学软件BioEdit对测序结果进行序列比较,通过比较结果可以看到基因文库中序列的差异性较大,并且片段之间的同源性较低,表示基因文库中基因序列的随机性较好。

关键词：定向进化随机片段重聚pcr 基因文库组成型表达载体序列分析

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基于发卡DNA自组装金胶比色检测DNA及分子识别文库的构建

基于发卡DNA自组装金胶比色检测DNA及分子识别文库的构建

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作者：曹丽洁青岛科技大学

学位级别：硕士

1、基于发卡DNA自组装金胶比色检测DNA DNA是生物体内的遗传分子，DNA的检测通常与各种疾病的诊断相关，因此DNA检测具有重要的研究意义。目前由于DNA检测技术的不断进步，人们对其他生物分子如蛋白质、小分子物质的检测也可以转化为... 详细信息

1、基于发卡DNA自组装金胶比色检测DNA DNA是生物体内的遗传分子，DNA的检测通常与各种疾病的诊断相关，因此DNA检测具有重要的研究意义。目前由于DNA检测技术的不断进步，人们对其他生物分子如蛋白质、小分子物质的检测也可以转化为对DNA的检测。DNA检测的方法很多，比如纳米金比色检测、荧光分析检测、化学发光检测、比色检测、电化学检测和荧光定量pcr等。鉴于纳米金比色检测的简单、肉眼可见等优点，本课题提出了基于发卡DNA催化自组装及目标循环放大的方法比色检测DNA。实验中设计两条发卡DNA探针H1、H2，当目标DNA不存在时，发卡DNA形成稳定的茎环结构。当加入目标DNA之后，目标DNA将H1链的茎环结构打开，H1链又会将打开H2链的茎环结构，两者形成互补结构，同时目标DNA被置换下来并引发下一轮的链置换反应从而实现信号放大，末端修饰金纳米颗粒的H1、H2链互补后使金胶颗粒间距减小，金胶发生聚沉并产生肉眼可见的颜色变化。该方法操作简单、灵敏度高、费用低，不需要借助大型仪器便可直接用肉眼观察实验结果。实验条件下，检测到目标DNA的最低浓度为2.2nM，而且该实验方法对于目标DNA的检测信号远大于发生碱基错配的DNA的检测信号，因此选择性良好。 2、蛋白质分子识别文库的构建生物分子识别元件是生物传感器主要组成部分。寻找多样的生物分子识别元件是生物传感器的重要发展方向之一。在此部分，我们主要利用组合基因模块的定向进化方法来构建多样性的基因文库，寻找新型的蛋白质识别分子。为便于筛选，本实验以卡那霉素抗性基因作为识别分子来验证识别文库构建方法的有效性。首先从GeneBank中查询卡那霉素抗性基因序列并进行结构域分析，根据二级结构设计基因片段进行基因重组。此方法的创建必将对难以找到识别分子的检测目标，如新的靶点受体的筛选，预防和治疗新发现的病毒等发挥积极的作用。

关键词：纳米金信号放大 DNA分子识别文库重聚pcr

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丙型肝炎病毒C和E1区的DNA改组

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中西医结合肝病杂志 2005年第6期15卷 343-345页

作者：赵甫涛贾战生李谨革黄长形王春雨魏欣李光玉白雪帆中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心陕西西安710038

目的:利用DNA改组技术进行不同亚型的HCVC和E1区的人工进化。方法:首先利用pcr扩增两段具有较高序列同源性的1kb左右的基因片段,两者相比较同源性大于83%。然后将其等量混合,在Mg2+存在的条件下,用DNaseⅠ切割成50bp左右的小片段。这些... 详细信息

目的:利用DNA改组技术进行不同亚型的HCVC和E1区的人工进化。方法:首先利用pcr扩增两段具有较高序列同源性的1kb左右的基因片段,两者相比较同源性大于83%。然后将其等量混合,在Mg2+存在的条件下,用DNaseⅠ切割成50bp左右的小片段。这些小片段在不外加引物的条件下,利用pcr反应进行重聚,再将重聚物经过一轮正常的pcr扩增。结果:获得了与原来片段大小相当的基因片段。结论:这一技术为进一步筛选高活性的HCVC和E1区打下基础,有利于从一组序列同源性程度较高的基因库构建随机嵌合基因,并为改组其他基因家族提供了借鉴。

关键词：肝炎病毒,丙型 DNA改组重聚pcr 定向进化

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丙型肝炎病毒C区的DNA改组

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医学研究生学报 2006年第3期19卷 195-198页

作者：赵甫涛贾战生李谨革王春雨魏欣白雪帆第四军医大学唐都医院解放军感染病诊疗中心陕西西安710038

目的:利用DNA改组技术进行不同基因型别丙型肝炎病毒(HCV)基因组C区的人工进化。方法:首先利用pcr扩增了三段具有较高序列同源性的460 bp基因片段,然后将其等量混合,在Mg2+存在的条件下,用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)切割成50 bp左右的小... 详细信息

目的:利用DNA改组技术进行不同基因型别丙型肝炎病毒(HCV)基因组C区的人工进化。方法:首先利用pcr扩增了三段具有较高序列同源性的460 bp基因片段,然后将其等量混合,在Mg2+存在的条件下,用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)切割成50 bp左右的小片段。这些小片段在不外加引物的条件下,利用pcr反应进行重聚,再将重聚物经过一轮正常的pcr扩增。结果:获得了与原片段大小相当的基因片段。结论:这一技术为进一步筛选高活性的HCV C区基因打下基础,有利于从一组序列同源性程度较高的基因库构建随机嵌合基因,并为改组其他基因家族提供了借鉴。

关键词：肝炎病毒丙型 DNA改组重聚pcr 定向进化

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