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中学生物教学 2018年第11期 39-40页

作者：刘二俊安徽省潜山县野寨中学 246300

从2018年全国高考Ⅰ卷第38题入手,回顾博耶和科恩的重组dna表达实验,它成功证明了dna是可转移的,质粒可以作为基因转移的载体,外源基因可以在原核细胞中表达,可以实现跨物种的基因交流,给教学一定的启示。

关键词：高考题重组dna表达证明

青蛤I型溶菌酶和鲤鱼β-防御素的毕赤酵母表达系统构建及其重组dna表达

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青蛤I型溶菌酶和鲤鱼β-防御素的毕赤酵母表达系统构建及其重组DN...

作者：冯付霭上海海洋大学

学位级别：硕士

青蛤(Cyclina sinensis)是无脊椎动物,生活在沿海地区,是我国重要的经济贝类之一,其作为滤食性的水产生物,拥有超强的抗逆能力。贝类物种进化水平比较低,虽然没有特异的免疫细胞和相关抗体,但是它们有自己的免疫机制:有血细胞和体液免... 详细信息

青蛤(Cyclina sinensis)是无脊椎动物,生活在沿海地区,是我国重要的经济贝类之一,其作为滤食性的水产生物,拥有超强的抗逆能力。贝类物种进化水平比较低,虽然没有特异的免疫细胞和相关抗体,但是它们有自己的免疫机制:有血细胞和体液免疫相互关联、相互作用,抵御外源异物的侵蚀。一些活性物质如:凝集素、抗菌肽、溶酶体酶(Lysozyme)都由血细胞或者血淋巴分泌。它们和异物的特异位点结合,发挥作用,裂解异物,一起维持本身机体环境的稳定。鲤鱼(Cyprinus carpio)是大宗淡水鱼养殖的一个重要品种,近来渔业高质量发展,除了养殖业水平提升以外,与鱼类自身免疫也有很大关系。众所周知,鱼类所生活的水环境有多种污染物质,在市场的长途运输中,也需要抵御可能出现的腐烂风险。由文献可知,鲤鱼本身产生的抑菌物质为防御素,主要在上皮组织中,如:体表、小肠等。同家族的大防御素成熟肽的N端的疏水性质保证了本身盐离子稳定性,且与细菌接触后,N末端域会驱动防御素组装成纳米网,可以捕获并杀死细菌,而成熟肽C端含有阳离子氨基酸残基,赋予了大防御素对革兰氏阴性菌的抗性功能。从之前的文献中可知,对于青蛤或者鲤鱼有些许研究,但未见其对鲤鱼防御素以及青蛤I型溶菌酶有真核表达方面的研究。同时我们知道,对贝类或者鱼类来说,其本身产生的抑菌物质的量不多,如果直接采用化学方法提取,则技术不成熟,且抑菌物质会有损失,投入的成本也很大。因此,对于I型溶菌酶以及鲤鱼β-防御素进行真核表达研究则恰到好处。首先,重组I型溶菌酶和β-防御素基因可以避免以上缺陷,且重组目的基因可以定向表达出目的溶菌酶和防御素,之后分泌出的目的蛋白不会形成包涵体,获取、纯化步骤较为简单,且技术较为成熟。本研究志在为水产品来源的天然抗菌物质提供在毕赤酵母中的重组dna表达技术。本研究的第一阶段聚焦于青蛤I型溶菌酶基因的cdna克隆以及重组表达载体的构建研究。通过RT-PCR获得编码青蛤I型溶菌酶的成熟肽基因,该基因的成熟肽有14个半胱氨酸残基,形成7对二硫键,氨基酸残基总数162个。设计引物,通过PCR扩增反应,在该基因成熟肽的N端添加Xho I、Kex 2;C端添加Xba I、6×His标签,最终获得目的基因“CslyI”。构建重组表达载体pPICZαA-CslyI,之后线性化,将其电转入毕赤酵母X-33中,通过高浓度的博来霉素进行筛选,以挑选出甲醇利用快速型高拷贝酵母转化子。提取阳性酵母转化子基因组,进行PCR验证。本研究第二阶段聚焦于青蛤I型溶菌酶在毕赤酵母中的重组表达以及其抑菌活性研究。将筛选得到的高拷贝酵母转化子在YPD培养基中复活,再转入BMMG培养基中积累菌体,48 h后离心、水洗,再转入BMMY培养基中,添加甲醇,在29℃、250 r/min条件下诱导表达72 h,之后离心培养液取上清。用滤膜对上清过滤除菌、再超滤浓缩至25倍,用Tricine-SDS-PAGE进行分析。之后再进行Western blot和MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,证明其为预期的重组目的蛋白CslyI。之后在同种条件下分不同诱导时间取上清,探究对重组蛋白表达量的影响,结果显示96 h的诱导时间相对较好。之后取阳性酵母转化子发酵上清对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)按照一定体积比例进行孵育,用平板菌落计数法探究重组目的蛋白的抑菌能力,结果显示,重组目的蛋白对以上三种细菌有较好的抑制作用;再将阳性酵母转化子发酵上清在不同温度下处理后,和细菌孵育一定时间,在酶标仪中检测三种细菌的细胞浓度,其结果可以反映出目的蛋白对三种细菌的抑菌性能,以研究目的蛋白的热稳定性。结果显示,经不同的温度处理后的发酵上清和未经处理后的组别其抑菌差异不显著,证明了重组目的蛋白的稳定性较好。本研究第三阶段聚焦于人工合成鲤鱼β-防御素在毕赤酵母中的重组dna表达研究。本研究中的目的基因根据鲤鱼β-防御素登录号:JF343439.1,查找出其成熟肽基因序列号,并在成熟肽的N端、C端分别添加限制性酶切位点和信号肽识别位点,交由上海生工生物工程有限公司合成。鲤鱼β-防御素的基本信息如下:其目的基因编码的成熟肽有45个氨基酸残基,其中的6个半胱氨酸残基可以在空间上形成3对二硫键。在成熟肽基因的5’端成功添加有Xho I、Kex 2以及6×His标签,在成熟肽基因3’端有Xba I酶切位点,鲤鱼β-defensin的理论分子量为6.39 kD,pI为8.4。之后常规操作提取质粒、双酶切、和表达载体pPICZαA连接、电击转入毕赤酵母等,最后在29℃、250 r/min条件下添加1%体积比的甲醇进行诱导表达,用滤膜对发

关键词：青蛤 I型溶菌酶鲤鱼 β-防御素重组dna表达

鳜鱼β-defensin成熟肽在毕赤酵母中的重组dna表达

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鳜鱼β-defensin成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达

紫贻贝ⅰ型溶菌酶在毕赤酵母中的重组dna表达

2018年中国水产学会学术年会

作者：吕星星陶妍上海海洋大学食品学院

Defensin主要分布于水生生物的脾脏中,是一种富含半胱氨基酸的阳离子小分子抗菌肽,具有独特的抗菌机制和广谱的抗菌、抗病毒活性以及免疫调节功能,因此,被广泛应用于新药研发和免疫疗法。根据defensin的空间结构可以将其分为不同的类型... 详细信息

Defensin主要分布于水生生物的脾脏中,是一种富含半胱氨基酸的阳离子小分子抗菌肽,具有独特的抗菌机制和广谱的抗菌、抗病毒活性以及免疫调节功能,因此,被广泛应用于新药研发和免疫疗法。根据defensin的空间结构可以将其分为不同的类型,本研究以鳜鱼（Siniperca chuatsi）的成熟肽Sc BD为研究对象,通过RT-PCR从鳜鱼脾脏中克隆到编码ScBD的c dna,将其与表达载体pPICZαA连接,并构建重组表达载体pPICZαA-ScBD,然后电转至毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33中,得到的阳性转化子在28℃、250 r/m的条件下,经1.0%甲醇诱导表达96h后,获得的表达产物经Tricine-SDS-PAGE分析,重组蛋白的分子量约为6.345 kDa;经MALDI-TOF-TOF质谱鉴定显示,该重组体蛋白为预期的目的蛋白。

关键词：鳜鱼 β-defensin 重组dna表达毕赤酵母

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紫贻贝ⅰ型溶菌酶在毕赤酵母中的重组DNA表达

紫贻贝大防御素在毕赤酵母中的重组dna表达

2016年中国水产学会学术年会

作者：王强厚陶妍上海海洋大学食品学院

溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应分子,在机体免疫系统中发挥重要作用。本研究根据毕赤酵母（pichia pastoris）的密码子偏爱性,人工合成紫贻贝i型溶菌酶的成熟肽基因（mMgIL）,其全长cdna为393bp,编码131个氨基酸残基。将mMgI... 详细信息

溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应分子,在机体免疫系统中发挥重要作用。本研究根据毕赤酵母（pichia pastoris）的密码子偏爱性,人工合成紫贻贝i型溶菌酶的成熟肽基因（mMgIL）,其全长cdna为393bp,编码131个氨基酸残基。将mMgIL与表达载体pPICZαA连接,构建重组表达载体pPICZαA-mMgIL,电转至毕赤酵母X-33细胞,利用MD、MM和含抗生素zeocin的YPD培养基筛选高拷贝阳性转化子。对阳性转化子在29℃、pH6.0条件下进行1.0%甲醇诱导表达96h。SDS-PAGE和Western blot分析显示重组紫贻贝ⅰ型溶菌酶在毕赤酵母中成功表达。

关键词：紫贻贝 ⅰ型溶菌酶毕赤酵母重组dna表达

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紫贻贝大防御素在毕赤酵母中的重组DNA表达

斑点叉尾NK-lysin成熟肽在毕赤酵母中的表达

2016年中国水产学会学术年会

作者：崔旭陶妍上海海洋大学食品学院

大防御素是一种具有广谱抗菌活性的抗菌肽,是参与生物先天性免疫的关键因子,具有杀灭病菌、保护机体的作用。本研究选取双壳类软体动物紫贻贝的大防御素成熟肽基因mMGBD作为研究对象,根据毕赤酵母的密码子偏爱性对该基因进行优化合成,... 详细信息

大防御素是一种具有广谱抗菌活性的抗菌肽,是参与生物先天性免疫的关键因子,具有杀灭病菌、保护机体的作用。本研究选取双壳类软体动物紫贻贝的大防御素成熟肽基因mMGBD作为研究对象,根据毕赤酵母的密码子偏爱性对该基因进行优化合成,将其与表达载体pPICZαA连接后电转至毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33中,得到的阳性转化子在29℃、经0.75%甲醇诱导表达72小时后,通过SDS-PAGE分析证明重组大防御素rmMGBD得到成功表达。

关键词：紫贻贝大防御素重组dna表达毕赤酵母

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淡水渔业 2017年第1期47卷 78-83页

作者：吴慧陶妍上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306

NK-lysin是毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的具有抗菌作用的多肽,在机体免疫系统中发挥重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。NK-lysin的生物学功能主要由其成熟肽(m NK-lysin)决定。本文在已有斑点叉尾(Ictalurus punctatus)NK-ly... 详细信息

NK-lysin是毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的具有抗菌作用的多肽,在机体免疫系统中发挥重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。NK-lysin的生物学功能主要由其成熟肽(m NK-lysin)决定。本文在已有斑点叉尾(Ictalurus punctatus)NK-lysin成熟肽原核重组表达载体p ET-32a(+)-m NK-lysin的基础上,通过PCR在m NK-lysin的5’端和3’端分别添加EcoRI和Xba I酶切位点,并在3’端添加6×His标签以便于纯化;扩增到的片段与表达载体p PICZαA连接构建重组表达载体p PICZαA-m NK-lysin,转化至毕赤酵母X-33细胞中,通过博来霉素筛选以及对酵母转化子基因组的PCR鉴定得到高拷贝酵母转化子;在29℃,250 rpm,采用0.5%甲醇进行诱导表达;表达产物经固化金属离子亲和层析(IMAC)获得纯化的重组体m NK-lysin。经Tricine-SDS-PAGE分析,其分子量约为11.5 k D;经Western blot分析,证明m NK-lysin在毕赤酵母中成功表达。

关键词：斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus) NK-lysin成熟肽毕赤酵母重组dna表达

斑点叉尾鮰C型溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

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生物技术通报 2017年第7期33卷 195-202页

作者：冯亚东陶妍李雯崔旭王强厚上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306

C型溶菌酶是存在于各种生物组织中的数种溶菌酶成员中的一员,是重要的细胞内免疫蛋白,具有稳定的空间结构和显著的抑菌功能,被认为是良好的食品保鲜剂和饲料添加剂。为了开发鱼类来源的C型溶菌酶,研究建立了基于毕赤酵母(Pichia pastor... 详细信息

C型溶菌酶是存在于各种生物组织中的数种溶菌酶成员中的一员,是重要的细胞内免疫蛋白,具有稳定的空间结构和显著的抑菌功能,被认为是良好的食品保鲜剂和饲料添加剂。为了开发鱼类来源的C型溶菌酶,研究建立了基于毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统的斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)C型溶菌酶的制备方法。首先通过PCR获得5'和3'端分别添加Xho I和Xba I酶切位点的编码斑点叉尾鮰C型溶菌酶的c dna(cflyC),其编码由127个氨基酸残基组成的多肽;将该cflyC与表达载体p PICZαA连接以构建重组表达载体p PICZαA-cflyC;转化至毕赤酵母X-33后,通过不同浓度的博来霉素和对酵母基因组dna的PCR鉴定,筛选得到高拷贝的酵母转化子;经0.5%甲醇诱导,在p H6.0、29℃、250 r/min下培养144 h,得到的表达产物经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化,得到重组蛋白;经Tricine-SDS-PAGE分析,表明重组蛋白的分子量为15.1 k D;进一步通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,证明该重组蛋白为预期的重组cflyC。通过福林酚法测得重组cflyC的表达量为2.75 mg/L。琼脂糖凝胶扩散法和酶活力测定证明,重组cflyC对枯草芽孢杆菌具有抑菌活性。本研究首次实现了斑点叉尾鮰C型溶菌酶在毕赤酵母中的重组dna表达,为其大规模制备奠定了基础。

关键词：斑点叉尾鮰 C型溶菌酶毕赤酵母重组dna表达抑菌活性

三疣梭子蟹C型溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

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生物技术通报 2018年第10期34卷 135-142页

作者：王强厚陶妍崔旭颜倩倩张亚莉上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306

C型溶菌酶是存在于各种生物组织中的重要的先天性免疫蛋白,是开发天然抑菌剂的良好候选者。以甲壳类动物三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)C型溶菌酶成熟肽为研究对象,首先通过RT-PCR克隆其编码基因"ptlyC";以pPICZαA为表达载体,... 详细信息

C型溶菌酶是存在于各种生物组织中的重要的先天性免疫蛋白,是开发天然抑菌剂的良好候选者。以甲壳类动物三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)C型溶菌酶成熟肽为研究对象,首先通过RT-PCR克隆其编码基因"ptlyC";以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA-ptlyC,电转至毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33后,通过高浓度的博来霉素筛选到高拷贝酵母转化子;在28℃、250 r/min和pH6.0的条件下,经1%的甲醇诱导表达72 h,得到含重组ptlyC的培养液上清;经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化,得到分子量约为25.3 kD的纯化产物。通过菌落计数法证明含重组ptlyC的培养液上清具有抑制革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性;通过琼脂糖凝胶扩散法证明纯化的重组ptlyC具有抑制革兰氏阴性的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和沙门氏菌(Salmonella lignieres)的活性。

关键词：三疣梭子蟹 C型溶菌酶毕赤酵母重组dna表达抑菌活性

斑点叉尾LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

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上海海洋大学学报 2017年第1期26卷 23-30页

作者：孙立人陶妍高北上海海洋大学食品学院上海201306 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306

LEAP2(Liver expressed antimicrobial peptide-2)抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽,它们在动物的免疫系统中发挥了重要作用。斑点叉尾(Ictalurus punctatus)LEAP2的一级结构由信号肽和原前体肽组成;原前体肽由66个氨基酸... 详细信息

LEAP2(Liver expressed antimicrobial peptide-2)抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽,它们在动物的免疫系统中发挥了重要作用。斑点叉尾(Ictalurus punctatus)LEAP2的一级结构由信号肽和原前体肽组成;原前体肽由66个氨基酸残基组成,近羧基端的41个残基组成了其成熟肽区域(m LEAP2),该区域决定了LEAP2的生物学活性。本文以斑点叉尾m LEAP2为研究对象,通过建立毕赤酵母表达系统,实现了m LEAP2在毕赤酵母中的重组dna表达,优化的表达条件为:29℃、p H 6、250 r/min、0.5%甲醇、120 h。Tricine-SDS-PAGE分析表明:表达产物经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后,获得了高纯度的目的蛋白。经Folin-酚法测定,纯化产物的浓度为0.22 mg/m L,推算至表达量为2.2 mg/L。进一步通过MALDI-TOF/TOF质谱分析对纯化产物的结构进行鉴定,结果证明:获得的纯化产物为预期的重组体m LEAP2(rm LEAP2)。此外,抑菌实验结果显示rm LEAP2具有明显的抑制枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性。

关键词：斑点叉尾 LEAP2成熟肽毕赤酵母重组dna表达

三疣梭子蟹PtCrustin2抗菌肽基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

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生物学杂志 2019年第4期36卷 42-46页

作者：王艳慧陶妍上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心

Crustin是一系列富含半胱氨酸的甲壳动物来源的抗菌肽,是甲壳动物非特异性免疫机制中的重要免疫因子,其生物学功能由C端的成熟肽区域决定。参考三疣梭子蟹( Portunus trituberculatus ) PtCrustin2成熟肽的cdna序列,根据毕赤酵母( Pichi... 详细信息

Crustin是一系列富含半胱氨酸的甲壳动物来源的抗菌肽,是甲壳动物非特异性免疫机制中的重要免疫因子,其生物学功能由C端的成熟肽区域决定。参考三疣梭子蟹( Portunus trituberculatus ) PtCrustin2成熟肽的cdna序列,根据毕赤酵母( Pichia pastoris )的密码子偏爱性对其相关密码子进行优化,合成5′端含 Xho Ⅰ限制性位点和Kex2信号肽酶切位点、3′端含 Xba Ⅰ限制性位点和6×his标签的目的基因“ smPtCrustin2 ”;以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA- smPtCrustin2,将其转入毕赤酵母X-33细胞后,通过含高浓度博来霉素的抗性平板筛选高拷贝甲醇利用快速型酵母转化子;筛选获得的酵母转化子在28 ℃、250 r/min条件下,使用0.5%甲醇诱导表达目的蛋白,并通过固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行分离纯化。Tricine-SDS-PAGE分析显示:纯化的重组体smPtCrustin2的分子量约为9.6 ku,并形成分子量约20 ku的二聚体。Western Blot分析进一步证明了纯化产物为预期的目的蛋白。建立的毕赤酵母表达系统获得了表达量为22.4 mg/L的重组体smPtCrustin2。

关键词：三疣梭子蟹 PtCrustin2成熟肽密码子优化毕赤酵母重组dna表达